梅毒实验室诊断技术的发展现状及评价(1)
【关键词】梅毒；实验室诊断；评价
文章编号：1003-1383(2012)02-0269-03中图分类号：R 759.104.46文献标识码：A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2012.02.059
梅毒(syphilis)是由苍白螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病。绝大多数是通过性途径传播，人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯全身各组织与器官，具有隐匿性，病程较长，人类对梅毒无先天免疫性，仅能在受感染后产生感染性免疫，已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再次感染。梅毒是我国重点防治的性传播疾病之一，发病率呈逐年增加的趋势[1]。梅毒的实验室检查对疾病诊断、疗效观察和判断复发具有重要的意义，为了方便各实验室选择合适的检测方法，本文就梅毒的实验室诊断技术现状作一综述和评价。
一、梅毒螺旋体病原学检查
, 百拇医药
早期梅毒在梅毒螺旋体(TP)非特异性抗体和特异性抗体还未产生或量较少时，是诊断梅毒最好的方法，而且检查羊水中的TP对诊断先天性梅毒具有重要的意义。检测的方法主要有以下几种：①暗视野显微镜检查：可用于有新鲜黏膜损伤的活动期早期梅毒患者的诊断，取硬下疳和扁平湿疣组织渗出液以及肿大淋巴结或羊水抽出液行盐水涂片镜检，在暗视野显微镜下观察可见螺旋状微生物。口腔和肛门等部位存在除TP以外的其他条件致病螺旋体，在暗视野显微镜下不易区分。虽然该方法简便直观且经济，但易受内用及外用药的影响，敏感性较低，对晚期及潜伏梅毒患者不适用[2]。②镀银染色或墨汁染色检查：取材涂片经镀银或墨汁染色后，通过普通光学显微镜即可观察到TP的形态，实验要求不高，适用于基层，但易受取材、外用药和送检时间等影响而出现假阴性的报告。③多功能显微诊断仪检查：是一种结合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，可直接观察TP而不需染色及其他处理，具有方便、快速和准确等优点，对一期梅毒的诊断率较高，但仪器价格昂贵，未能在实验室中普及[3]。④直接荧光抗体检查：用异硫氰酸荧光素标记TP单克隆抗体，在荧光显微镜下，出现黄绿色荧光表明TP阳性[2]。可与其他条件致病螺旋体区分，灵敏性高于暗视野检查，可检测皮损分泌物、新鲜或甲醛固定组织中的梅毒螺旋体，但需要荧光显微镜且技术条件要求高，不适用于基层实验室。⑤家兔感染实验及TP培养：实验条件要求高，目前仅用于科研方面，未能有效在临床中推广应用[3]。
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二、梅毒螺旋体血清学检查
梅毒血清学试验是梅毒诊断最主要的实验室检查方法，TP感染人体后4～10周，机体可产生两种抗体，一种是机体感染后组织受到破坏释放出类脂成分，而后刺激机体产生抗类脂质抗体，即非特异性抗体，另一种是抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体。其血清学检查方法主要有以下几种。
1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验 美国CDC认可的磷脂类抗体检测实验包括：①性病研究实验室试验(VDRL)；②不加热血清反应素试验(USR)；③快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)；④甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)，以上试验的原理大致相同，只是在方法学上有所改良。VDRL是唯一被推荐用来检测脑脊液反应素的试验，对诊断神经性梅毒(包括无症状的)具有重要意义。VDRL和USR需要借助显微镜进行观察，目前实验室常规筛查试验多采用RPR和TRUST两种，结果只需肉眼观察是否有相应颜色(黑色或红色)的凝集颗粒出现[2]。由于早期梅毒在下疳出现1～2周内心磷脂抗体出现较晚，晚期梅毒即使是未治疗的患者也可能转阴，因此该类试验对早期、晚期、潜伏期梅毒和神经梅毒的诊断不敏感，会出现假阴性。溶血、脂血和不新鲜的标本、器具污染等因素以及受一些疾病的影响还可出现“生物学假阳性”。试验还存在“血清固定”和“前带现象”，故非TP抗原血清学试验存在一定的局限，可作为梅毒筛查、疗效观察、复发和再感染判断的指标[4]，不能作为TP确诊的依据。
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2.梅毒螺旋体抗原血清学试验采用TP作为抗原检测血清中抗梅毒螺旋体IgG和/或IgM抗体，其方法学的敏感性和特异性均高于非TP抗原血清学试验，一般用作确认试验[5]，对于非TP抗原血清学试验阳性结果真假性的判断，以及潜伏梅毒和晚期梅毒的诊断具有重要的意义。①酶联免疫吸附试验(TPELISA)：将基因重组的梅毒螺旋体膜特异性多肽抗原包被在酶标板孔上，用双抗原夹心法测定梅毒特异性抗体，该方法操作简单，结果易于保存，可应用于多份样本自动化检测系统，是目前批量筛查和检测梅毒的一种首选方法[6]。有报道[7]ELISA法和TPPA法具有高度相关性，且不受样本中纤维蛋白和溶血等影响。②血球凝集试验(TPHA)：由于试剂中采用的红细胞具有生物细胞活性，会产生非特异性凝集，造成生物学假阳性，且红细胞保存时间有限，因此在临床使用中存在些实际问题。TPHA的试剂较贵，操作较繁琐费时，需要熟练技术人员进行操作，以避免误差。目前可作为国内梅毒筛查阳性的确证试验之一。③明胶颗粒凝集试验(TPPA)：TPPA原理与TPHA大致相同，只是将致敏粒子改为明胶颗粒，避免了生物因素(异嗜性抗体)造成的影响，增加了试剂的稳定性，操作上更为简化，敏感性和特异性也得到了提高。是美国疾病预防控制中心2002年推荐的梅毒确证试验，也是我国实验室近年来临床常用的梅毒确诊试验[5]。④荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTAABS)：FTAABS法是以Nichols株TP作为抗原，以FITC标记的抗人球蛋白为示踪剂，检测待测血清(预先用Reiter株TP吸附)中的特异性抗体。该试验具有一定的主观性，需要熟练的技术人员和性能较优的荧光显微镜才能保证准确度，因此实验室没有将其作为常规方法运用。FTAABS法被认为是“金标准”试验，具有特异性高、敏感性强的特点，可作为确证试验，但有报道显示[9]FTAABS在用于检测合并有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的神经性梅毒患者时易出现假阳性。⑤快速检测试验(包括乳胶凝集试验和胶体金试验)：是利用基因重组制备高度纯化的单克隆TP抗原检测待测血清中的TP特异性抗体的一种诊断技术。其操作简单，结果易读，适用于快速检验，得到了各实验室的认可和应用。乳胶凝集试验的敏感度与TPPA大致相同，而特异性则稍高，两种方法的一致性达98.8%[10]，是一种理想的快速确诊试验。胶体金试验存在一定的假阴性，在潜伏期梅毒和晚期梅毒时容易漏诊，所以只能作为一般的筛检试验[11]。⑥免疫印迹试验(WIT)：免疫印迹法是20世纪80年代发展起来的先进检测技术，它结合了免疫学和分子生物学的特点。该试验是用聚丙烯凝胶电泳将TP上的各种抗原分子分开，再转移到硝酸纤维膜上与待测抗体结合，如果出现特异性抗原区带(47kD、17.5kD、15.5kD和45kD)即可诊断，其它螺旋体及正常人血清为阴性反应[12]。虽然WIT的试剂费用较高，但对早期梅毒、潜伏梅毒和神经梅毒的检测敏感性高，特异性强，操作简便，判断结果客观准确重复性好，是目前常用且较优的梅毒确诊方法。
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3.梅毒螺旋体IgM与IgG 抗体的检测在自身免疫性疾病患者、毒麻品成瘾者以及1%健康人群(特别是高龄老年人[13])中，TPIgG抗体血清学试验可出现生物学假阳性。由于免疫记忆作用，在治愈后很长时间内仍然存在较高的阳性率，甚至终身阳性，因此其阳性只能说明现症感染或曾经感染过，不能判断疾病是否处于活动期，因此不能作为疗效监测的手段[1415]。TPIgG抗体出现较晚，单独检测易发生漏诊，TP19SIgM抗体是梅毒螺旋体感染人体2周后，从血清中检测出的最早抗体，通过FTAABS、TPELISA等方法检测该抗体，用于早期诊断和疗效观察。母体中IgM抗体分子量较大不能通过胎盘，如检测出其阳性则提示胎儿已被感染，对诊断先天性梅毒具有重要的意义。治疗后IgM抗体水平可下降并消失，当再感染时，IgM会再次升高，因此检测IgM抗体还可以用于梅毒复发再感染的确诊指标。近年来应用TP基因工程成功研制了能同时检测IgM和IgG抗体的方法，灵敏度、特异性均较高[16]，但存在试剂价格高等缺点，因此在基层实验室中尚未普及。, 百拇医药(覃羽华)
文章编号：1003-1383(2012)02-0269-03中图分类号：R 759.104.46文献标识码：A
doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2012.02.059
梅毒(syphilis)是由苍白螺旋体引起的慢性、系统性性传播疾病。绝大多数是通过性途径传播，人体受感染后，螺旋体很快播散到全身，几乎可侵犯全身各组织与器官，具有隐匿性，病程较长，人类对梅毒无先天免疫性，仅能在受感染后产生感染性免疫，已完全治愈的早期梅毒患者仍可以再次感染。梅毒是我国重点防治的性传播疾病之一，发病率呈逐年增加的趋势[1]。梅毒的实验室检查对疾病诊断、疗效观察和判断复发具有重要的意义，为了方便各实验室选择合适的检测方法，本文就梅毒的实验室诊断技术现状作一综述和评价。
一、梅毒螺旋体病原学检查
, 百拇医药
早期梅毒在梅毒螺旋体(TP)非特异性抗体和特异性抗体还未产生或量较少时，是诊断梅毒最好的方法，而且检查羊水中的TP对诊断先天性梅毒具有重要的意义。检测的方法主要有以下几种：①暗视野显微镜检查：可用于有新鲜黏膜损伤的活动期早期梅毒患者的诊断，取硬下疳和扁平湿疣组织渗出液以及肿大淋巴结或羊水抽出液行盐水涂片镜检，在暗视野显微镜下观察可见螺旋状微生物。口腔和肛门等部位存在除TP以外的其他条件致病螺旋体，在暗视野显微镜下不易区分。虽然该方法简便直观且经济，但易受内用及外用药的影响，敏感性较低，对晚期及潜伏梅毒患者不适用[2]。②镀银染色或墨汁染色检查：取材涂片经镀银或墨汁染色后，通过普通光学显微镜即可观察到TP的形态，实验要求不高，适用于基层，但易受取材、外用药和送检时间等影响而出现假阴性的报告。③多功能显微诊断仪检查：是一种结合相差对比、暗视野及偏振光的可变投影显微镜，可直接观察TP而不需染色及其他处理，具有方便、快速和准确等优点，对一期梅毒的诊断率较高，但仪器价格昂贵，未能在实验室中普及[3]。④直接荧光抗体检查：用异硫氰酸荧光素标记TP单克隆抗体，在荧光显微镜下，出现黄绿色荧光表明TP阳性[2]。可与其他条件致病螺旋体区分，灵敏性高于暗视野检查，可检测皮损分泌物、新鲜或甲醛固定组织中的梅毒螺旋体，但需要荧光显微镜且技术条件要求高，不适用于基层实验室。⑤家兔感染实验及TP培养：实验条件要求高，目前仅用于科研方面，未能有效在临床中推广应用[3]。
, 百拇医药
二、梅毒螺旋体血清学检查
梅毒血清学试验是梅毒诊断最主要的实验室检查方法，TP感染人体后4～10周，机体可产生两种抗体，一种是机体感染后组织受到破坏释放出类脂成分，而后刺激机体产生抗类脂质抗体，即非特异性抗体，另一种是抗梅毒螺旋体抗原的特异性抗体。其血清学检查方法主要有以下几种。
1.非梅毒螺旋体抗原血清学试验 美国CDC认可的磷脂类抗体检测实验包括：①性病研究实验室试验(VDRL)；②不加热血清反应素试验(USR)；③快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)；④甲苯胺红不加热血清反应素试验(TRUST)，以上试验的原理大致相同，只是在方法学上有所改良。VDRL是唯一被推荐用来检测脑脊液反应素的试验，对诊断神经性梅毒(包括无症状的)具有重要意义。VDRL和USR需要借助显微镜进行观察，目前实验室常规筛查试验多采用RPR和TRUST两种，结果只需肉眼观察是否有相应颜色(黑色或红色)的凝集颗粒出现[2]。由于早期梅毒在下疳出现1～2周内心磷脂抗体出现较晚，晚期梅毒即使是未治疗的患者也可能转阴，因此该类试验对早期、晚期、潜伏期梅毒和神经梅毒的诊断不敏感，会出现假阴性。溶血、脂血和不新鲜的标本、器具污染等因素以及受一些疾病的影响还可出现“生物学假阳性”。试验还存在“血清固定”和“前带现象”，故非TP抗原血清学试验存在一定的局限，可作为梅毒筛查、疗效观察、复发和再感染判断的指标[4]，不能作为TP确诊的依据。
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2.梅毒螺旋体抗原血清学试验采用TP作为抗原检测血清中抗梅毒螺旋体IgG和/或IgM抗体，其方法学的敏感性和特异性均高于非TP抗原血清学试验，一般用作确认试验[5]，对于非TP抗原血清学试验阳性结果真假性的判断，以及潜伏梅毒和晚期梅毒的诊断具有重要的意义。①酶联免疫吸附试验(TPELISA)：将基因重组的梅毒螺旋体膜特异性多肽抗原包被在酶标板孔上，用双抗原夹心法测定梅毒特异性抗体，该方法操作简单，结果易于保存，可应用于多份样本自动化检测系统，是目前批量筛查和检测梅毒的一种首选方法[6]。有报道[7]ELISA法和TPPA法具有高度相关性，且不受样本中纤维蛋白和溶血等影响。②血球凝集试验(TPHA)：由于试剂中采用的红细胞具有生物细胞活性，会产生非特异性凝集，造成生物学假阳性，且红细胞保存时间有限，因此在临床使用中存在些实际问题。TPHA的试剂较贵，操作较繁琐费时，需要熟练技术人员进行操作，以避免误差。目前可作为国内梅毒筛查阳性的确证试验之一。③明胶颗粒凝集试验(TPPA)：TPPA原理与TPHA大致相同，只是将致敏粒子改为明胶颗粒，避免了生物因素(异嗜性抗体)造成的影响，增加了试剂的稳定性，操作上更为简化，敏感性和特异性也得到了提高。是美国疾病预防控制中心2002年推荐的梅毒确证试验，也是我国实验室近年来临床常用的梅毒确诊试验[5]。④荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTAABS)：FTAABS法是以Nichols株TP作为抗原，以FITC标记的抗人球蛋白为示踪剂，检测待测血清(预先用Reiter株TP吸附)中的特异性抗体。该试验具有一定的主观性，需要熟练的技术人员和性能较优的荧光显微镜才能保证准确度，因此实验室没有将其作为常规方法运用。FTAABS法被认为是“金标准”试验，具有特异性高、敏感性强的特点，可作为确证试验，但有报道显示[9]FTAABS在用于检测合并有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的神经性梅毒患者时易出现假阳性。⑤快速检测试验(包括乳胶凝集试验和胶体金试验)：是利用基因重组制备高度纯化的单克隆TP抗原检测待测血清中的TP特异性抗体的一种诊断技术。其操作简单，结果易读，适用于快速检验，得到了各实验室的认可和应用。乳胶凝集试验的敏感度与TPPA大致相同，而特异性则稍高，两种方法的一致性达98.8%[10]，是一种理想的快速确诊试验。胶体金试验存在一定的假阴性，在潜伏期梅毒和晚期梅毒时容易漏诊，所以只能作为一般的筛检试验[11]。⑥免疫印迹试验(WIT)：免疫印迹法是20世纪80年代发展起来的先进检测技术，它结合了免疫学和分子生物学的特点。该试验是用聚丙烯凝胶电泳将TP上的各种抗原分子分开，再转移到硝酸纤维膜上与待测抗体结合，如果出现特异性抗原区带(47kD、17.5kD、15.5kD和45kD)即可诊断，其它螺旋体及正常人血清为阴性反应[12]。虽然WIT的试剂费用较高，但对早期梅毒、潜伏梅毒和神经梅毒的检测敏感性高，特异性强，操作简便，判断结果客观准确重复性好，是目前常用且较优的梅毒确诊方法。
, 百拇医药
3.梅毒螺旋体IgM与IgG 抗体的检测在自身免疫性疾病患者、毒麻品成瘾者以及1%健康人群(特别是高龄老年人[13])中，TPIgG抗体血清学试验可出现生物学假阳性。由于免疫记忆作用，在治愈后很长时间内仍然存在较高的阳性率，甚至终身阳性，因此其阳性只能说明现症感染或曾经感染过，不能判断疾病是否处于活动期，因此不能作为疗效监测的手段[1415]。TPIgG抗体出现较晚，单独检测易发生漏诊，TP19SIgM抗体是梅毒螺旋体感染人体2周后，从血清中检测出的最早抗体，通过FTAABS、TPELISA等方法检测该抗体，用于早期诊断和疗效观察。母体中IgM抗体分子量较大不能通过胎盘，如检测出其阳性则提示胎儿已被感染，对诊断先天性梅毒具有重要的意义。治疗后IgM抗体水平可下降并消失，当再感染时，IgM会再次升高，因此检测IgM抗体还可以用于梅毒复发再感染的确诊指标。近年来应用TP基因工程成功研制了能同时检测IgM和IgG抗体的方法，灵敏度、特异性均较高[16]，但存在试剂价格高等缺点，因此在基层实验室中尚未普及。, 百拇医药(覃羽华)