桂西壮族散发性激素耐药型肾病综合征NPHS2基因多态性分析研究(2)
1.3.3PCR扩增NPHS2的PCR扩增反应体系为25 μl，包括2 μl 的基因组DNA，2xTaq Platinum PCR Master Mix(其中NPHS2基因的1号外显子富含GC碱基，其为2xTaq GCrich PCR Master Mix)12.5 μl，ddH20为8.5 μl(由北京天根生化科技有限公司提供)。PCR循环条件：94℃预变性3 min后进入循环：变性94℃共30 s，退火温度50℃～62℃(退火温度根据各个引物的Tm值加以调整)30 s，72℃ 2 min(其中NPHS2基因的1号外显子高GC，其为72℃1 min)，共30次循环。最后72℃延伸5 min。采用2%的琼脂糖凝胶鉴定扩增目的片段的大小。1.3.4序列测定选择NPHS2基因外显子1～8号条带显示清晰的PCR产物，委托北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司，依据Sanger测序原理，DNA条带测序用ABI3730自动测序仪进行直接检测，再以Chromas软件打开测序文件并与DNA序列峰图对比，以峰图为准得出每例标本的序列，使用NCBI Blast 在线软件(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi) 进行序列比对 ......
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