PCR检测中出现的假阳性和假阴性问题分析
中图分类号：R446文献标识码：B文章编号：1004-7484(2011)18-0068-02
开展 PCR 应具有一定的条件，需要一个正规的PCR 实验室，采集标本、核酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行；需有严密的防污染措施、假阳性和假阴性结果的质控等。实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能，能够及时发现和纠正实验中的问题。目前，我国在 PCR 应用中尤其是在临床诊断中存在问题较多，主要表现为：PCR试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低，PCR 的应用范围过宽等，因此造成 PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性结果。我们结合两年的实践经验就这个问题做了分析，以提高检验质量，现综述如下：
1 模板的制备过程
得到纯正的模板，是PCR检测成功的关键性的一步。而导致这一步假性结果的原因也很多，假阳性是由于核酸的污染造成的。而污染的主要来源有以下几个方面。
, 百拇医药
1.1 由于交叉感染所致的标本中含有大量的靶分子。
1.2 来自微生物的质粒克隆可大量存在于实验室的仪器，设备和试剂中。扩增子的污染是最重要的核酸污染来源，每一PCR容器可含有多达1012拷贝的扩增子，甚至最微细的气溶胶小滴(lO^ul)也含有多达105个潜存的靶分子。
由于污染对新的核酸扩增有很大影响。因此在操作中，必须注意消除污染和隔离应用一次性的材料，胶管头、试管、操作室要分隔为PCR前和PCR后处理室。
PCR结果也可能出现假阴性，在模板的制备中可能出现的原因有很多，但在实验时我们发现假阴性最多时是由于试剂和标本的反复冻融。如：试剂中蛋白酶K若反复冻融5次以上，消化蛋白酶K的活力会降低甚至丧失，不能扩增出目的DNA而造成假阴性。据文献报道，冻融2次阳性率降低37.5%。冻融3次阳性率降低57.2%。
2 扩增
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扩增中出现假阳性和假阴性的原因较少，主要是试剂污染或扩增管污染而造成的假阳性。出现假阴性的主要原因是引物设计不佳，或引物含量较低；另一方面可能是扩增仪的温度低，没有达到变性的温度。低温下复性的要求，这时就要及时测量和调节扩增仪的温度，以保证结果的准确。
3 电泳
电泳时操作不规范也会影响结果判定：
3.1 电泳制胶时，梳子不清洁，胶孔不整齐，而出现星状拖尾或弯曲不齐现象。
3.2 琼脂糖溶解不充分，影响结果观察。
3.3 制胶和电泳槽中用的缓冲液应相同，且电泳槽中缓冲液要及时更换。 ‘
3.4 规范的点样操作是先将胶板放在电泳槽中，以免先点样时样品散落在泳液巾导致阴性结果。
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4 PCR产物的鉴定
PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来，PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。
综上所述， PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。
参考文献
[1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992, 252:1643.
[2] 叶顺章.聚合酶链反应在性病诊断中的应用[J].中华皮肤科杂志,1996,29(3)：73.
[3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr,1995,53(4):155., 百拇医药(郑甲兰)
开展 PCR 应具有一定的条件，需要一个正规的PCR 实验室，采集标本、核酸提取、扩增及产物分析应在不同的房间进行；需有严密的防污染措施、假阳性和假阴性结果的质控等。实验者应具有一定的分子生物学理论知识及实验技能，能够及时发现和纠正实验中的问题。目前，我国在 PCR 应用中尤其是在临床诊断中存在问题较多，主要表现为：PCR试剂的考核、审查工作薄弱，许多单位实验条件不符合要求，部分操作人员的理论和实验知识水平较低，PCR 的应用范围过宽等，因此造成 PCR 实验结果的可靠性差，出现较多的假阳性、假阴性结果。我们结合两年的实践经验就这个问题做了分析，以提高检验质量，现综述如下：
1 模板的制备过程
得到纯正的模板，是PCR检测成功的关键性的一步。而导致这一步假性结果的原因也很多，假阳性是由于核酸的污染造成的。而污染的主要来源有以下几个方面。
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1.1 由于交叉感染所致的标本中含有大量的靶分子。
1.2 来自微生物的质粒克隆可大量存在于实验室的仪器，设备和试剂中。扩增子的污染是最重要的核酸污染来源，每一PCR容器可含有多达1012拷贝的扩增子，甚至最微细的气溶胶小滴(lO^ul)也含有多达105个潜存的靶分子。
由于污染对新的核酸扩增有很大影响。因此在操作中，必须注意消除污染和隔离应用一次性的材料，胶管头、试管、操作室要分隔为PCR前和PCR后处理室。
PCR结果也可能出现假阴性，在模板的制备中可能出现的原因有很多，但在实验时我们发现假阴性最多时是由于试剂和标本的反复冻融。如：试剂中蛋白酶K若反复冻融5次以上，消化蛋白酶K的活力会降低甚至丧失，不能扩增出目的DNA而造成假阴性。据文献报道，冻融2次阳性率降低37.5%。冻融3次阳性率降低57.2%。
2 扩增
, 百拇医药
扩增中出现假阳性和假阴性的原因较少，主要是试剂污染或扩增管污染而造成的假阳性。出现假阴性的主要原因是引物设计不佳，或引物含量较低；另一方面可能是扩增仪的温度低，没有达到变性的温度。低温下复性的要求，这时就要及时测量和调节扩增仪的温度，以保证结果的准确。
3 电泳
电泳时操作不规范也会影响结果判定：
3.1 电泳制胶时，梳子不清洁，胶孔不整齐，而出现星状拖尾或弯曲不齐现象。
3.2 琼脂糖溶解不充分，影响结果观察。
3.3 制胶和电泳槽中用的缓冲液应相同，且电泳槽中缓冲液要及时更换。 ‘
3.4 规范的点样操作是先将胶板放在电泳槽中，以免先点样时样品散落在泳液巾导致阴性结果。
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4 PCR产物的鉴定
PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳可判断其长度是否为预期的长度，但只有通过杂交试验或序列分析等才能判断其特异性。严格说来，PCR 产物均应通过实验证实其特异性。在我国一些科研论文和临床检测中缺乏这一环节。
综上所述， PCR 具有其优点，但也有不足之处，它是一种很好的科研手段，但作为常规诊断方法尚需进一步改进和提高。目前的关键问题是如何正确应用 PCR 。虽然 PCR 尚未在包括美国等发达国家作为常规诊断方法，但如果具备开展 PCR 需要的条件， PCR 是可作为辅助诊断手段使用的。目前，只有针对 PCR 应用中存在的问题，采取措施，正确应用 PCR，才能使这一技术在科研和临床工作中发挥应有的作用。
参考文献
[1] Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy. Annu Rev Biochem, 1992, 252:1643.
[2] 叶顺章.聚合酶链反应在性病诊断中的应用[J].中华皮肤科杂志,1996,29(3)：73.
[3] Billiald P, Goyffon M, PCR: principles and prospects in clinical bilology. Ann Pharm Fr,1995,53(4):155., 百拇医药(郑甲兰)