ERK信号通路在癫痫大鼠海马中的激活及托吡酯的保护作用
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[摘要] 目的：采用氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠实验模型，研究急性致痫大鼠海马中ERK蛋白及下游NF-κB的活性改变，并观察托吡酯(TPM)的干预作用。方法:取健康wistar大鼠36只，随机分成5组，对照组，氯化锂-匹罗卡品处理组和三个剂量的TPM组。应用免疫印迹法检测海马组织中ERK蛋白磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，并观察TPM干预后的行为学改变。结果：(1)急性癫痫发作后0.5h,除对照组外各组大鼠海马组织中磷酸化ERK及活化NF-κB水平均升高；(2)发作2.5h后，处理组大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平均下降，但仍高于正常水平；而TPM中剂量及高剂量干预组中大鼠海马组织磷酸化ERK及活化NF-κB水平明显高于低剂量组及处理组结论：ERK通路在大鼠癫痫急性发作的海马体中能被激活，自发保护神经元细胞阻止凋亡，NF-кB参与此过程；而托吡酯能将激活的持续时间延长，激活的后续水平提高，这可能是TPM保护作用的重要机制。
关键词: 癫痫；ERK ； NF-κB； 托吡酯
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1004-7484(2012)06-0100-03
作为神经系统的常见疾病之一，癫痫在我国的发病率已超过7‰,目前研究表明，癫痫的发生于离子通道、神经胶质细胞及神经递质都有密切关系[1]。现有的药物已能在很大程度上控制癫痫的急性发作，但是癫痫反复发作后会造成一定程度脑损伤，导致神经元凋亡以及功能失调，尚不能完全解决[2]。托吡酯(TPM)是由氨基磺酸酯取代单糖的新型抗癫痫药物，能通过切断钠通道，提高GABA激活受体的频率。有研究表明，TPM还具有保护神经元作用，其机制尚未明确[3]。本实验通过复制急性癫痫大鼠模型，并通过观察癫痫大鼠行为学，探讨TPM的干预作用，最后通过免疫印迹法，观察ERK蛋白的磷酸化及下游NF-κB 蛋白表达的变化，进一步探讨TPM对神经元的保护作用的可能机制，为其临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验分组给药及癫痫模型的制备
健康清洁级成年wistar大鼠实验36只，雌雄不限，体重(200 ±30)g,实验分组见表1
组别n给药方式
对照组5腹腔注射5ml生理盐水
氯化锂—匹罗卡品组
(处理组)6腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品
TPM低剂量组7腹腔注射TPM20 mg/kg，1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品
TPM中剂量组7腹腔注射TPM40 mg/kg
1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品
TPM高剂量组7腹腔注射TPM80 mg/kg
1h后腹腔注射氯化锂3 mmol/kg, 24小时后注射30 mg/kg匹鲁卡品
1.2行为学观察
腹腔内注射后连续观察大鼠行为, 并记录癫痫发作的潜伏期、 发作程度和持续时间, 参考 Racine 分级标准[4]。
1.3 取材及核蛋白提取及蛋白样本制备
发作后0.5h，将中剂量TPM干预组中4只及处理组中3只大鼠予戊巴比妥钠 (80 mg/kg)深麻醉, 迅速断头、咬开颅骨、剥出双侧海马；发作后2.5h，照以上方法处死剩余动物并取材。
组织核蛋白提取试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，将组织匀浆后按试剂盒要求提取核蛋白。
1.4western blot检测ERK磷酸化水平和NF-κB 蛋白活化
用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法转膜，含5%脱脂奶粉的PBS封闭液封闭1h后加入一抗 ......
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