酶联免疫吸附试验过程中的影响因素分析
【关键词】ELISA影响因素
【中图分类号】Q178.1+2【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-01
酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年问世以来,以其敏感性高,特异性强,操作简便,安全,而广泛应用于临床诊断,开创了免疫学诊断的新纪元。但ELISA测定中影响因素较多,有时可见到一些假阳性或假阴性,本文就ELISA过程中的影响因素做如下讨论。
1 检验标本中含有酶标记物的干扰物
1.1 外源性干扰物
常常因样品采集、储存、处理不当造成,如样品溶血、被细菌污染、标本凝集不全等。溶血标本,红细胞溶解破裂,释放出血红素,血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物,以HRP(辣根过氧化酶)为标记ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色,形成假阳性。有国内报道酶免HbsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性[1];如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP而影响结果,形成假阳性[2];标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深,一般血清置4℃冰箱5天内完成测试,如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,建议保存6个月为宜,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡[3];标本凝集不全时,血清中会残留部分纤维蛋白原,也易造成假阳性,最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟。
, 百拇医药
1.2 内源性干扰物
类风湿因子(RF)、黄疸等。类风湿因子作用于多种动物以及人lgGFc段的自身抗体,能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应,从而形成假阳性;黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶,如用HRP为标记物,就有可能产生假阳性。
ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,因此,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化.
2 试剂的影响
不同厂家生产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别,资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%-99.3%,78%-89%存在较大差异[4]。有的厂家酶标板孔间吸光度(A)值大于15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。
, 百拇医药 从冰箱取出试剂及冷藏的待检标本,室温下平衡30分钟再进行测试,剩余试剂及时封存,置冰箱备用。
3 检测过程
3.1 加样
加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊导致清洗困难,因此应使用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。
每次加样应更换吸嘴,做到一人一吸头,以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸2-3次。
加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
样本稀释,目的是为了减少非特异性反应,所以一定要先加稀释液后加样本,特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟,同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
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如果标本量不够一板,在掰取微孔反应条时,手指不要接触反应条底部,以免污染底部,使透光率减少,结果的吸光度值升高,形成假阳性。
如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去1滴或2滴有气泡的试剂后加样。
3.2 加酶液
加酶液时一定要垂直滴加到反应孔的中央,不要把酶液溅到或滴到反应孔的上部,以免洗板时不能彻底把酶液洗净而出现假阳性。
3.3 孵育
96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围及内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异,干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,水的高度以浸过小孔1/3处为宜,孵育温度为37℃±1℃为宜,时间为试剂说明书为准,如反应时间长,会造成整板本底高,阳性率高。为避免蒸发,板上应加盖。
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3.4 洗板
洗板是ELISA操作的重要环节,应引起操作者重视,无论是手工操作还是机器操作,得出不正确的结果与不正确的洗涤有关,ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物为目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。如在洗涤过程中,血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机小孔全阻塞或半阻塞状态,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性,因此要在洗板机洗板时要不时地观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水或蒸馏水冲洗管道,避免堵孔。
3.5 显色
加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。
3.6 读板
, http://www.100md.com 酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,最好使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。在用酶标仪读数时最好先擦拭微孔板底部并压平板条。使用酶标仪前,先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。
4 人员与质量控制
检验人员的因素在质量体系中起决定性作用,单位检验技术人员的培训和岗位继续再教育同检验质量的关系相当密切。定期培训可以提高检验人员的自身素质,学习新技能,改变旧观点。
质量控制包括分析前、分析中和分析后的质量控制。同时每次测试都要有空白、阴性、阳性对照和质控血清。空白、阴性、阳性对照的吸光度在一定范围内。弱阳性的标本应复查或稀释后复查,以排除前带现象。每批试验的质控血清必须能检出,并记录S/CO值,作出质控图,以便更深入的分析。
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总之,在检测工作中, ELISA影响因素很多,必须排除各种影响因素的干扰才能为临床提高正确可靠的检测结果。
参考文献
[1]李宇飞.溶血对乙型肝炎表面抗原检测结果的影响[J].长冶医学院学报,2005,12(9):19.
[2]唐秋民,赵斌,蒋利星.血浆低温保存对检测HBsAg和抗-HCV的影响[J].广西医科大学,2003,20(4):553-554.
[3]胡建慧,殷网虎.血清标本的保存温度和时间对乙型肝炎两对半定量测定的影响[J].检验医学与临床,2007,4(9):810-811.
[4]金英爱,王春茹,赵淑华,等.ELISA检测乙肝两对半的影响因素[J].中国社区医师,2007,9(171):81.
作者单位:唐山钢铁公司医院检验科063020, 百拇医药
【中图分类号】Q178.1+2【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-01
酶联免疫吸附试验(ELISA)自1971年问世以来,以其敏感性高,特异性强,操作简便,安全,而广泛应用于临床诊断,开创了免疫学诊断的新纪元。但ELISA测定中影响因素较多,有时可见到一些假阳性或假阴性,本文就ELISA过程中的影响因素做如下讨论。
1 检验标本中含有酶标记物的干扰物
1.1 外源性干扰物
常常因样品采集、储存、处理不当造成,如样品溶血、被细菌污染、标本凝集不全等。溶血标本,红细胞溶解破裂,释放出血红素,血红素中的铁卟啉是过氧化物酶的类似物,以HRP(辣根过氧化酶)为标记ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色,形成假阳性。有国内报道酶免HbsAg试剂检测溶血标本时可造成假阳性[1];如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP而影响结果,形成假阳性[2];标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合,使间接法的试剂本底加深,一般血清置4℃冰箱5天内完成测试,如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,建议保存6个月为宜,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡[3];标本凝集不全时,血清中会残留部分纤维蛋白原,也易造成假阳性,最好将血液先自然存放1-2小时后,再用3000rmp离心15分钟。
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1.2 内源性干扰物
类风湿因子(RF)、黄疸等。类风湿因子作用于多种动物以及人lgGFc段的自身抗体,能充当抗原成分与固相及酶标抗体反应,从而形成假阳性;黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶,如用HRP为标记物,就有可能产生假阳性。
ELISA的灵敏度>1ng/ml水平上,因此,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化.
2 试剂的影响
不同厂家生产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别,资料显示,不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%-99.3%,78%-89%存在较大差异[4]。有的厂家酶标板孔间吸光度(A)值大于15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。
, 百拇医药 从冰箱取出试剂及冷藏的待检标本,室温下平衡30分钟再进行测试,剩余试剂及时封存,置冰箱备用。
3 检测过程
3.1 加样
加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性,直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊导致清洗困难,因此应使用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗,定期校准。
每次加样应更换吸嘴,做到一人一吸头,以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸2-3次。
加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
样本稀释,目的是为了减少非特异性反应,所以一定要先加稀释液后加样本,特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟,同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
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如果标本量不够一板,在掰取微孔反应条时,手指不要接触反应条底部,以免污染底部,使透光率减少,结果的吸光度值升高,形成假阳性。
如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去1滴或2滴有气泡的试剂后加样。
3.2 加酶液
加酶液时一定要垂直滴加到反应孔的中央,不要把酶液溅到或滴到反应孔的上部,以免洗板时不能彻底把酶液洗净而出现假阳性。
3.3 孵育
96孔酶标板结构特别,易产生边缘效应,抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求,酶标板周围及内部孔升降温速率不同,造成周边与内部孔结果差异,干浴与水浴存在明显的差异,尽可能使用水浴,并要求固相板放入水中,水的高度以浸过小孔1/3处为宜,孵育温度为37℃±1℃为宜,时间为试剂说明书为准,如反应时间长,会造成整板本底高,阳性率高。为避免蒸发,板上应加盖。
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3.4 洗板
洗板是ELISA操作的重要环节,应引起操作者重视,无论是手工操作还是机器操作,得出不正确的结果与不正确的洗涤有关,ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物为目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。如在洗涤过程中,血清中残留的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机小孔全阻塞或半阻塞状态,造成未结合标记酶洗脱不彻底,导致“花板”造成假阳性或假阴性,因此要在洗板机洗板时要不时地观察洗板机针孔内洗液的通畅状况,及时纠正,洗板机不用时应用去离子水或蒸馏水冲洗管道,避免堵孔。
3.5 显色
加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。
3.6 读板
, http://www.100md.com 酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,最好使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。在用酶标仪读数时最好先擦拭微孔板底部并压平板条。使用酶标仪前,先预热仪器15-30分钟,测读结果更稳定。
4 人员与质量控制
检验人员的因素在质量体系中起决定性作用,单位检验技术人员的培训和岗位继续再教育同检验质量的关系相当密切。定期培训可以提高检验人员的自身素质,学习新技能,改变旧观点。
质量控制包括分析前、分析中和分析后的质量控制。同时每次测试都要有空白、阴性、阳性对照和质控血清。空白、阴性、阳性对照的吸光度在一定范围内。弱阳性的标本应复查或稀释后复查,以排除前带现象。每批试验的质控血清必须能检出,并记录S/CO值,作出质控图,以便更深入的分析。
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总之,在检测工作中, ELISA影响因素很多,必须排除各种影响因素的干扰才能为临床提高正确可靠的检测结果。
参考文献
[1]李宇飞.溶血对乙型肝炎表面抗原检测结果的影响[J].长冶医学院学报,2005,12(9):19.
[2]唐秋民,赵斌,蒋利星.血浆低温保存对检测HBsAg和抗-HCV的影响[J].广西医科大学,2003,20(4):553-554.
[3]胡建慧,殷网虎.血清标本的保存温度和时间对乙型肝炎两对半定量测定的影响[J].检验医学与临床,2007,4(9):810-811.
[4]金英爱,王春茹,赵淑华,等.ELISA检测乙肝两对半的影响因素[J].中国社区医师,2007,9(171):81.
作者单位:唐山钢铁公司医院检验科063020, 百拇医药