大鼠去大骨瓣减压术后脑组织NF—κB表达的实验研究(1)
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【摘要】 目的 研究大鼠重型脑损伤后去大骨瓣减压组和非去大骨瓣减压组NF-κB的表达变化。方法 应用改良Feeney’s自由落体脑损伤打击装置制成大鼠重型脑损伤模型，运用免疫组化染色法检测假手术组、非去大骨瓣减压组和去大骨瓣减压组在不同时间点NF-κB的表达。结果 假手术组无明显阳性表达，实验组各个时间点均有不同程度阳性表达，其阳性细胞数呈现一个动态的变化过程：伤后6h在伤灶及其周围即有多量阳性细胞，12h阳性细胞数继续增加，24h明显增加并达到高峰，然后迅速下降；NDC组与DC组在24h，72h，120h及168h比较差异有显著性。结论 去大骨瓣减压可能通过降低NF-κB表达继而减轻炎症反应来减轻二次脑损伤。
【关键词】 去大骨瓣减压；重型颅脑损伤；NF-κB
文章编号：1004-7484(2013)-02-0555-02
创伤性脑损伤是世界性的多发性疾病，也是死亡率和致残率最高的疾病之一。研究认为NF-κB的活化是引发脑外伤后继发性生化级联反应的关键步骤，在创伤性脑水肿的病理生理发生发展过程中有着重要的作用[1]。本研究通过比较去大骨瓣减压组和非去大骨瓣减压组大鼠重型脑损伤后NF-κB的表达，拟探讨NF-κB在去大骨瓣减压的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 SPF级成年SD大鼠90只，雌雄不限，体重250-350g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组(简称SH组，6只)，非去大骨瓣减压组(简称NDC组，42只)和去大骨瓣减压组(简称DC组，42只)(打击后6h、12h、24h、48h、72h、120h和168h各6只)。如果有死亡，则选择备用大鼠重新造模，补充至预定样本数。
1.2 模型的建立 动物模型采用改良Feeney's自由落体脑损伤装置制成。实验大鼠经2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定，头顶正中稍偏右纵行切开头皮约2.0cm，剥离骨膜，暴露右顶骨，用微型颅钻在冠状缝后1.5mm，中线旁2.0mm处钻一直径5.0mm骨窗，保持硬膜完整。将撞击圆锥置于硬膜上，用40g砝码于25cm高处沿空心导管坠落，通过撞击圆锥间接撞击硬膜，致右顶叶重型脑挫裂伤，打击后计时。NDC组大鼠止血后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮；DC组同时行去大骨瓣减压术，形成大小约0.8cm×1.0cm减压骨窗，放射状剪开硬膜，止血后缝合头皮；SH组仅钻孔，不打击。
1.3 标本处理 各时间点每组6只大鼠过量麻醉后快速断头取脑，在冰盘上切取脑挫裂伤灶脑组织块，迅速用4%多聚甲醛液固定24h后常规脱水、石蜡包埋，每个标本切片厚度5um，用于NF-κB和免疫组化染色。
1.4 免疫组化染色及阳性细胞计数 采用链霉素亲和素—生物素—过氧化酶复合物法(SABC法)，参照试剂盒说明书进行染色，一抗为NFκB p65(F-6)(浓度为1：50，购自美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC)，使用已知阳性切片做阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗进行免疫组化染色。
每张切片随机选取10个不重复视野(各组所选部位尽可能相同)，在高倍(10×40)镜下观察(相同条件)，运用HMIAS-2000高清晰度图像采集处理系统采图。采用直接计数法计算每个视野下阳性细胞数目，取其均值表示各切片的测定结果。
1.5 数据处理 结果以 表示，用SPSS13.0 for Windows及Excel 软件进行统计处理。多组间均数的两两比较采用单因素方差分析，显著性水平为0.05。
2 结果
胞浆和(或)胞核有颗粒状及条索状棕黄色沉淀为NF-κB阳性表达的细胞，不仅分布在血脑屏障的内皮细胞上，还可出现在神经元、神经胶质细胞、脑室壁和脉络丛的细胞上以及血管壁平滑肌细胞上，以内皮细胞表达为主、其次是星型胶质细胞。
假手术组无明显阳性表达，在损伤组各时间点均有NF-κB阳性表达的细胞，但阳性细胞数呈现一个动态的变化过程。脑损伤后6h在损伤灶及其周围皮质即有多量的NF-κB阳性细胞；脑损伤后12h阳性细胞数继续增加；脑损伤后24h，损伤区及其周围NF-κB阳性细胞数量明显增加，达到高峰，然后迅速下降；脑损伤后48h-168hNF-κB阳性细胞数逐渐下降。NDC组与DC组变化曲线相似，但NDC组在每个时间点的阳性细胞数均高于DC组，其中在24h、72h及168h差异有高度显著性(P<0.01)，120h差异有显著性(P<0.05)，但48h差异无显著性，见表1，图1、2。
3 讨论
标准外伤大骨瓣开颅术在临床上应用已三十多年，其基础与临床研究均取得了较大进步，但目前国内外在分子水平上的实验研究较少。随着医学分子生物学、免疫学、神经生物学的飞速发展，目前对脑损伤的研究已经深入到亚细胞及分子水平。NF-κB是在1986年由Sen和Baltimore[2]应用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)分析B细胞核提取物中发现的，因参与B细胞κ轻链的表达调控而得名 ......
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