小鼠LIGHT胞外段基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备(2)
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参见附件。
1.6 动物免疫
取100μL 融合蛋白，加入等体积弗氏完全佐剂，超声充分乳化后，皮下多点注射免疫新西兰大白兔。第一次免疫2w后，取100μL融合蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂超声乳化进行后，免疫第2次，间隔2w进行免疫第3次。同时设PBS免疫组为对照。免疫前及末次免疫后7d，心脏采血，分离兔血清，-20℃保存备用。
1.7 抗体效价测定
用间接ELISA法测定兔免疫血清中特异性抗体效价。用10μg/mL LIGHTECD抗原包被酶标板，每孔100μl，同时设GST蛋白和空白对照。4℃包被过夜，0.05%PBST 洗涤3 次后，用10%BSA 室温封闭1 h，加入倍比稀释的待测兔免疫血清，37℃温育1 h，用0.05%PBST 洗涤3 次，分别加入HRP 标记的羊抗兔IgG，37℃温育1 h，充分洗涤后，加入显色剂ABTS，37℃避光温育5～10min，用2mol/L H2SO4 终止反应，用酶标仪读取405 nm波长处OD值。实验组OD405 大于或等于GST 对照孔2倍以上判为阳性，以阳性者的血清最高稀释度定义为抗体效价，即抗体滴度。
1.8 融合蛋白免疫反应性鉴定
将纯化的LIGHTECD融合蛋白进行SDS- PAGE 电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂奶粉封闭后，以免疫兔血清为一抗，HRP 标记的羊抗兔IgG为二抗，进行Western blot 分析，鉴定LIGHTECD融合蛋白的免疫反应性。
2 结果
2.1 LIGHTECD的PCR扩增
提取小鼠骨髓来源的树突状细胞总mRNA，经RT-PCR扩增后，1.2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增得到525 bp大小的目的DNA片段，大小与预期结果相符(图1)。
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