双酚Ａ对硬骨鱼性腺分化的作用机制研究(2)
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参见附件(528KB，4页)。
图1 BPA对日本比目鱼性别比例的影响
每条鱼的性别判定依据于成年期生殖腺形态学和组织学观察检测。18℃对照,n=27; 27℃对照,n=40;
E2,1μg/g食料, n=23;
BPA,100μg/g食料, n=21
2.2 原位杂交分析各组生殖腺中P450arom mRNA的表达
图3(见封3)和表1显示原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom mRNA的表达。在18℃对照组(图3a)、E2组(图3c)和BPA组(图3d)的雌性生殖腺中P450arom mRNA有显著表达；然而在27℃模型组(图3b)的雄性生殖腺中没有表达。
2.3 原位杂交分析各组生殖腺中MIS mRNA的表达
图4(见封底)和表2显示原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中MIS
mRNA的表达。在18?C对照组(图4a)、E2组(图4c)和BPA组(图4d)的雌性生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；然而在27℃模型组(图4b)的雄性生殖腺中有极其明显的表达。
2.4 RT-PCR分析各组生殖腺中P450arom和MIS mRNA的表达。
表2组织学和原位杂交分析青年期生殖腺的小结
组别卵巢腔P450arom mRNA
表达的强弱MIS mRNA
表达的强弱18℃对照有+-27℃对照无-+++27℃+E2有+-27℃+BPA有+-表达位置基质细胞支持细胞
图5(见封底)显示RT-PCT分析每组各3条比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom 和MIS mRNA的表达，也进一步验证原位杂交获得的结果。在18℃对照组全部雌鱼和BPA组一条雌鱼的生殖腺中P450arom mRNA有显著表达，但这些生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；然而在27℃模型组全部雄鱼和BPA组的两条雄鱼的生殖腺中P450arom mRNA没有表达而MIS mRNA有显著的表达。
3 讨论
本研究中发现，雌二醇组雌性占到100%，剂量为1μg/g，只有BPA剂量100μg/g的1/100 。BPA雌性占57.1%，说明它比雌二醇对生殖腺的雌性化作用弱很多，只能在一定程度上抑制27℃较高水温对遗传学雌性比目鱼幼苗的雄性化作用，对生殖腺性分化具有一定的雌激素样作用。这可能因为两者与雌激素受体及其亚型的结合能力有所差别。本研究显示，BPA对27℃幼鱼的雌性化作用使生殖腺分化出了卵巢腔，卵巢腔是雌性卵巢分化特有的形态学标志[7]；通过原位杂交和RT-PCR分析均发现，卵巢腔出现的同时还伴随着P450arom mRNA表达的上调和MIS mRNA表达的下调。P450arom是催化雄激素转化为雌激素的关键酶；MIS是一种雄性体内能够抑制雌性生殖腺发育的激素。同样，原位杂交也显示雌二醇完全诱导雌性化，并在同一个生殖腺中诱导P450arom mRNA表达而抑制MIS mRNA表达，这些结果提示了BPA内分泌干扰作用机制和雌激素一样，是通过调节P450arom 和MIS mRNA的表达来发挥雌性化作用的。然而，BPA对P450arom 和MIS两个基因的转录调节机制仍不太清楚。
最近有研究报道，在鸡的体内，雌性生殖腺中转录因子FOXL2在时间和空间上与P450arom共同存在，并存在于P450arom的上游部位，因为在P450arom启动子内存在FOXL2的结合位点[8]。此外，P450arom酶抑制剂使鸡胚雄性化而导致FOXL2和P450arom mRNA的表达受到抑制[9]。因此，FOXL2很可能是诱导日本比目鱼P450arom转录活性的一个强有力的候选基因。
为了更进一步了解BPA对日本比目鱼这类硬骨鱼模型的性分化影响的分子机制，以后可继续在P450arom 和MIS两个基因的转录调节机制上进行研究，比如探索FOXL2这类转录因子能否直接诱导比目鱼P450arom的转录活性。此类实验研究能为预防此类环境相关性疾病、保护人类健康提供科学依据。
4 参考文献
[1]Frederick S. vom Saal，Claude Hughes.An Extensive New Literature Concerning Low-Dose Effects of Bisphenol A Shows the Need for a New Risk Assessment[J]. Environmental Health Perspectives, 2005, 113: 926 –933.
[2]Sonnenschein C, Soto AM. An updated review of environmenta1 estrogen and androgen mimics and antagonists[J]. J Steroid Biochem M of Biol ,1998 ,65(1) :143-150.
[3]Tabata K. Induction of gynogenetic diploid males and presumption of sex determination mechanisms in the hirame Paralichthys olivaceus[J]. Bull Jap Soc Sci Fish,1991,57: 845-850.
[4]Kitano T, Takamune K, Kobayashi T, et al. Suppression of P450 aromatase gene expression in sex-reversed males produced by rearing genetically female larvae at a high water temperature during a period of sex differentiation in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)[J] ......
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