壬基酚对Ｐ450ａｒｏｍ和ＭＩＳ基因表达的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 仪器
ADVANTEC培养箱CI410，TOMY蒸汽高压灭菌仪BS245，TOMY高速冷冻小型离心机MX100，ASTEC PCR仪，OLYMPUS显微镜。
1.2 试剂
壬基酚(NP)，购自日本和晃公司。
1.3 实验动物及染毒方法
实验中所有遗传学雌性日本比目鱼是用遗传学雌性和表型雄性比目鱼人工交配得来的[5]。幼鱼孵化后饲养在18℃低水温中直到染毒开始时为止。NP染毒方法是将NP按 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃水温下于幼鱼性分化时期喂食NP，即从鱼卵孵化后第30天到第100天对其染毒。另设18℃水温组、27℃水温组和1μg/g雌二醇
(E2)阳性组。
1.4性别判断
将比目鱼生殖腺固定于Bouin’s溶液里，置于4℃过夜，用乙醇脱水和石蜡包埋，连续切片5 μm厚，最后H.E.染色，镜检。表型性别的判断是通过对它们生殖腺的组织学观察来决定的[6]。
1.5 原位杂交法检测基因的表达
在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼的组织切片用1μg/mL的蛋白酶K磷酸缓冲液处理5 min，室温下，加入2 mg/mL氨基乙酸终止此反应5 min。组织玻片在磷酸缓冲液中漂洗2次后，用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定10 min，再漂洗2次后，组织切片与1μg/mL DIG标记的反义RNA探针杂交，此探针包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA[7]。在DIG Easy Hyb溶液中于55℃反应。杂交后的组织切片在50%甲酰胺溶液中漂洗2次，每次30 min。再用RNase A 于37℃下反应30 min，使用DIG核酸检测试剂盒(罗氏公司)测试mRNA的表达信号。
1.6 RT-PCR法检测基因的表达
总RNA是通过ISOGEN从第100天的青年期比目鱼的生殖腺中提取的：生殖腺在100 μL ISOGEN中被均质化，在均质液中加入20 μL氯仿，螺旋振荡5s，15000转/min离心15 min，移去上清液，转入新离心管内，加40 μL异丙醇，15000转/min离心30 min。移去上清液后，总RNA沉淀用70%乙醇洗涤，空气中干燥后溶于DEPC处理过的水中。RT反应使用RNA PCR试剂盒和温度循环仪完成。第一链cDNA合成于总RNA，总RNA在65℃中变性10 min，于42℃下在RT混合液中共同培养30 min，再于99℃ 5 min。PCR反应使用P450arom、MIS和延长因子(EF-1α)基因特异性引物对，引物对序列为P450arom：5'-ATC GGA TCC CTG CCT GTG AC-3, 5'-TGGCTG ATG CTC TGC TGA GG-3'；MIS：5'-TGA CCC GTA CCT ACG AGC TG-3', 5'-TCG TCC ACG TTC TCG CTC TC-3'；EF-1α：5'-AGT TCG AGA AAG AAG CTG CC-3', 5'-ATC CAG AGC ATC CAG CAG TG-3' 扩增长度分别为344 bp，291 bp和577 bp，循环数分别为30，25和25次。使用转录产物cDNA作为PCR混合液中的模板。PCR条件是：95℃预热10 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，末次延伸于72℃ 5 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在溴乙锭溶液中染色，UV灯下成像。
2结果
2.1 NP暴露对比目鱼性别决定的干扰
本次研究从组织学上观察了18℃水温组27条鱼、27℃水温组40条鱼、E2组23条鱼、NP组20条鱼，从图1中可见，当遗传学雌性幼鱼给予正常食料喂养并控温在18℃时，组织学检查发现鱼的生殖腺分化为椭圆的含有卵巢腔的雌性生殖腺-卵巢(Tanaka曾报道卵巢腔是比目鱼性腺分化过程中雌性特有的形态学标志[8])，说明几乎所有幼鱼都能发育成正常雌鱼(雌性占96.3%)。然而，当幼鱼被喂养在27℃水温时，所有比目鱼都发育成表现型的雄鱼(雌性比例为0%)，可以观察到生殖腺发育成狭长的精巢，不含有卵巢腔。与此相比， E2组和NP组染毒后，即使幼鱼饲养在27℃水温，仍被全部或部分诱导分化成雌鱼，E2组雌性占100%，NP组雌性占30%；而且，组织学检查中也没有发现卵巢-精巢同体的比目鱼，能准确判断这种鱼的性别。
图1 NP暴露对比目鱼的雌性化诱导作用
2.2 P450arom基因表达的强度
表1说明了原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom mRNA的表达。在18℃对照组、E2组和NP组的雌性生殖腺中P450arom mRNA有显著表达；而在27℃模型组的雄性生殖腺中没有表达。
表1 原位杂交检测第100天生殖腺中P450arom基因的表达
[JZ]组别卵巢腔P450arom mRNA的表达有明显无未见有明显有明显
2.3 MIS基因表达的强度
由表2可见原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中MIS mRNA的表达。在18℃对照组、E2组和NP组比目鱼的雌性生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；而在27℃模型组的雄性生殖腺中有极其明显的表达。
表2比目鱼生殖腺中MIS基因的表达
组别[]MIS mRNA的表达未见极强未见未见
2.4 RT-PCR检测基因表达的性别特异性
图2显示RT-PCT分析每组各3条比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom和MIS mRNA的表达，也进一步验证原位杂交获得的结果。在NP组(A)1条雌鱼和18℃对照组(B)全部雌鱼的生殖腺中P450arom mRNA有显著表达，但这些生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；而在27℃模型组(C)全部雄鱼和NP组(A)的2条雄鱼的生殖腺中P450arom mRNA没有表达而MIS mRNA有显著的表达 ......
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