探讨补阳还五汤类方成分的药代动力学比较研究
【摘 要】目的：对比分析补阳还五汤类方(补阳还五汤和脑健片)中阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯在大鼠体内的药代动力学特征。方法：将补阳还五汤类方灌胃颈静脉插管大鼠，采用HPLC-DAD法同时检测3种成分在不同时间点的血药浓度，经DAS2.0计算得单成分的药代动力学参数，再采用总量统计矩(相似度)法整合成整体药代动力学参数并进行比较。结果：3种成分在体内的总量统计参数相差甚远，而3种成分总和的统计矩参数却比较接近，补阳还五汤和脑健片在大鼠体内AUC分别为240.6和133.0，MRT分别为3.192 min和3.259 min，VRT分别为21.59 min2和19.75 min2；补阳还五汤和脑健片中3种成分总量的相似度达到0.977 8。结论：补阳还五汤和脑健片在体内代谢过程具有相似性，中药复方发挥功效依赖于多成分的整体贡献。
【关键词】药代动力学；补阳还五汤；脑健片；阿魏酸；洋川芎内酯A；藁本内酯
【中图分类号】R749.053 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019(2018)10-094-01
补阳还五汤类方包括补阳还五汤及其精简方(脑健片)。补阳还五汤出自《医林改错·瘫痿论》，由黄芪、川芎、当归等7味中药组成，系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辨证属气虚血瘀证的经典名方。脑健片处方是遵循补阳还五汤之方义，秉承“益气祛瘀生新法”，将补阳还五汤精简为黄芪、川芎和地龙，经过二次开发而成的新型制剂。本课题组前期研究表明，脑健片治疗脑缺血疗效显著[1-2]，现进一步对其代谢动力学进行研究，选择补阳还五汤类方均含有的阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯3种入血成分为检测指标，研究大鼠灌胃后体内药代动力学参数变化，旨在探讨精简方配伍变化后其同类成分的药物动力学变化行为。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 补阳还五汤干浸膏(黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，地龙3 g)和脑健片干浸膏(黄芪30 g，川芎9 g，地龙6 g)均由湖南省中医药研究院中药所张水寒教授提供，所有药材质量均符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原药材4.5 g/g。脑健片按新工艺制备，其中川芎以挥发油量为考察指标，对川芎粗粉进行SFE-CO2萃取，不加夹带剂，提取1.5 h；地龙以醇浸膏得率及氮含量为指标，温浸2次，第1次加5倍量50%乙醇温浸48 h，第2次加4倍量50%乙醇温浸48 h；再合并药渣，与黄芪药粉一同水煎，所有药液浓缩干燥后即得干浸膏，相当于原药材4.7 g/g。
阿魏酸对照品(批号MUST-12112204)、洋川芎内酯A对照品(批号MUST-12121202)、藁本内酯对照品(批号MUST- 12082702)，北京盈泽纳新化工技术研究院；乙腈，美国Tedia公司，色谱纯；甲醇，美国Tedia公司，色谱纯；怡宝纯净水(华润怡宝饮料有限公司)，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 Instech自动采血系统(Instech Solomon公司)，离心浓缩仪(Centri Vap，LABCONCO)，Agilent-1260型高效液相色谱仪，配有自动进样器，四元梯度泵，在线真空脱气机，柱温箱和二极管阵列检测器(DAD)；超声波清洗仪(SB-3200D，宁波新其生物科技股份有限公司)，分析天平(JA-3003，上海恒平科学仪器有限公司)，Elipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，安捷伦公司)。
1.3 动物 SPF级雄性SD大鼠20只，9～10周龄，体质量260～300 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK(湘)2011-0003。室温无菌喂养，自由饮食饮水。
1.4 分组、给药及处理 建立大鼠实时活体采血方法。将SD大鼠麻醉后固定于手术台上，切开颈下静脉，分离颈静脉，埋线，待血液充盈时用眼科剪将颈静脉剪开一小口，插入特制PU软管约20 mm深并固定，缝合伤口。灌胃后将插管大鼠与Instech自动采血系统连接。将颈静脉插管的健康SD大鼠分为补阳还五汤组和脑健片组，每组5只。二方均以4倍于人体剂量的原药材给药[3]，折算成干浸膏量分别为12.04 g/kg体质量和9.64 g/kg体质量。灌胃前采血作为空白血浆，再分别于5、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480 min采血0.5 mL，并取上层血浆，-80 ℃冰箱保存备用。
1.5 供试品溶液的制备 取药物血浆100 μL，加0.1 mol/L盐酸50 μL，混匀后加800 μL乙酸乙酯，涡旋震荡5 min，8000 r/min离心10 min，取上清液；重复上述操作，合并上清液，离心浓缩仪挥干溶剂后残渣用50 μL甲醇复溶。
1.6 对照品溶液的制备 分别精密称量阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品，用甲醇溶液制成浓度分别为0.125、0.1、2.5 g/L的标准溶液。其中阿魏酸对照品溶液中含5%乙酸，4 ℃冰箱避光保存备用，藁本内酯-20 ℃冰箱避光保存备用。
1.7 色谱条件 本研究采用HPLC-DAD法与脑健片体外成分测定建立的方法[4]一致。色谱条件：Elipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 ？m)，柱温30 ℃；以0.3%乙酸水(A)和乙腈(C)为流动相进行梯度洗脱(0～5 min，15% C；5～30 min，15%～31% C；30～32 min，31%～36% C；32～82 min，36%～72% C；82～90 min，72%～95% C)，流速1.0 mL/min；检测波长为阿魏酸325 nm、洋川芎内酯A 280 nm、藁本内酯328 nm。
1.8 数据分析 采用DAS2.0软件，分别获得阿魏酸、洋川芎内酯A和藁本内酯3种成分的经典药代动力学参数，参照文献[5-6]按总量统计矩(相似度)法计算药代动力学总量统计矩参数，并进行比较分析。
2 结果
系統适用性与专属性考察
分别取空白血浆，加入阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯标准品溶液的空白血浆，补阳还五汤和脑健片给药后30 min的药物血浆样本，处理后上样分析。结果显示血浆中内源性物质不干扰测定，该方法专属性良好。根据前期研究结果，由保留时间和紫外光谱图确定1号峰为阿魏酸，2号峰为洋川芎内酯A，3号峰为藁本内酯[4]。
3 讨论
中药发挥药效往往取决于多种药效成分的协同作用，讲究君臣佐使配伍原则。采用传统西药药代动力学模型对中药复方药代参数进行分析，发现同一药效成分在不同药效部位、不同药材及不同配伍复方中的药代动力学特征均不尽相同。采用传统西药单一成分药代动力学模型对中药多成分在体内药代动力学行为进行评价存在一定的局限性，不能充分体现补阳还五汤类方整体成分在体内的真实代谢过程。本研究采用总量统计矩参数对经典房室模型的药动参数继续深入分析，既能反映总量药物浓度的动力学行为，又能与单个成分的统计矩参数关联，是整合多成分药物动力学较宜的数学处理方法，同时更能体现出中药多种化学成分多靶点、多途径、多环节进行整合调节的优越性。
参考文献
[1] 刘芳，刘青萍，王宇红，等.补阳还五汤及其精简方抗脑缺血损伤功效比较[J].中国中医药信息杂志，2014，21(9)：46-49.
[2] 刘芳，王宇红，蔡光先，等.补阳还五汤及其精简方(脑健片)对脑缺血大鼠海马组织CDK4/Cyclin D1表达的影响[J].中国中药杂志，2015， 40(20)：4058-4062.
[3] 夏相宜，王宇红，蔡光先，等.脑健胶囊对MCAO大鼠脑水肿、脑梗死面积及体质量的影响[J].中医学报，2014，29(4)：532-534., 百拇医药(宋亚娟)
【关键词】药代动力学；补阳还五汤；脑健片；阿魏酸；洋川芎内酯A；藁本内酯
【中图分类号】R749.053 【文献标志码】B 【文章编号】1005-0019(2018)10-094-01
补阳还五汤类方包括补阳还五汤及其精简方(脑健片)。补阳还五汤出自《医林改错·瘫痿论》，由黄芪、川芎、当归等7味中药组成，系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辨证属气虚血瘀证的经典名方。脑健片处方是遵循补阳还五汤之方义，秉承“益气祛瘀生新法”，将补阳还五汤精简为黄芪、川芎和地龙，经过二次开发而成的新型制剂。本课题组前期研究表明，脑健片治疗脑缺血疗效显著[1-2]，现进一步对其代谢动力学进行研究，选择补阳还五汤类方均含有的阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯3种入血成分为检测指标，研究大鼠灌胃后体内药代动力学参数变化，旨在探讨精简方配伍变化后其同类成分的药物动力学变化行为。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 补阳还五汤干浸膏(黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，地龙3 g)和脑健片干浸膏(黄芪30 g，川芎9 g，地龙6 g)均由湖南省中医药研究院中药所张水寒教授提供，所有药材质量均符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原药材4.5 g/g。脑健片按新工艺制备，其中川芎以挥发油量为考察指标，对川芎粗粉进行SFE-CO2萃取，不加夹带剂，提取1.5 h；地龙以醇浸膏得率及氮含量为指标，温浸2次，第1次加5倍量50%乙醇温浸48 h，第2次加4倍量50%乙醇温浸48 h；再合并药渣，与黄芪药粉一同水煎，所有药液浓缩干燥后即得干浸膏，相当于原药材4.7 g/g。
阿魏酸对照品(批号MUST-12112204)、洋川芎内酯A对照品(批号MUST-12121202)、藁本内酯对照品(批号MUST- 12082702)，北京盈泽纳新化工技术研究院；乙腈，美国Tedia公司，色谱纯；甲醇，美国Tedia公司，色谱纯；怡宝纯净水(华润怡宝饮料有限公司)，其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 Instech自动采血系统(Instech Solomon公司)，离心浓缩仪(Centri Vap，LABCONCO)，Agilent-1260型高效液相色谱仪，配有自动进样器，四元梯度泵，在线真空脱气机，柱温箱和二极管阵列检测器(DAD)；超声波清洗仪(SB-3200D，宁波新其生物科技股份有限公司)，分析天平(JA-3003，上海恒平科学仪器有限公司)，Elipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，安捷伦公司)。
1.3 动物 SPF级雄性SD大鼠20只，9～10周龄，体质量260～300 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK(湘)2011-0003。室温无菌喂养，自由饮食饮水。
1.4 分组、给药及处理 建立大鼠实时活体采血方法。将SD大鼠麻醉后固定于手术台上，切开颈下静脉，分离颈静脉，埋线，待血液充盈时用眼科剪将颈静脉剪开一小口，插入特制PU软管约20 mm深并固定，缝合伤口。灌胃后将插管大鼠与Instech自动采血系统连接。将颈静脉插管的健康SD大鼠分为补阳还五汤组和脑健片组，每组5只。二方均以4倍于人体剂量的原药材给药[3]，折算成干浸膏量分别为12.04 g/kg体质量和9.64 g/kg体质量。灌胃前采血作为空白血浆，再分别于5、15、30、45、60、90、120、180、240、300、360、480 min采血0.5 mL，并取上层血浆，-80 ℃冰箱保存备用。
1.5 供试品溶液的制备 取药物血浆100 μL，加0.1 mol/L盐酸50 μL，混匀后加800 μL乙酸乙酯，涡旋震荡5 min，8000 r/min离心10 min，取上清液；重复上述操作，合并上清液，离心浓缩仪挥干溶剂后残渣用50 μL甲醇复溶。
1.6 对照品溶液的制备 分别精密称量阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯对照品，用甲醇溶液制成浓度分别为0.125、0.1、2.5 g/L的标准溶液。其中阿魏酸对照品溶液中含5%乙酸，4 ℃冰箱避光保存备用，藁本内酯-20 ℃冰箱避光保存备用。
1.7 色谱条件 本研究采用HPLC-DAD法与脑健片体外成分测定建立的方法[4]一致。色谱条件：Elipse XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 ？m)，柱温30 ℃；以0.3%乙酸水(A)和乙腈(C)为流动相进行梯度洗脱(0～5 min，15% C；5～30 min，15%～31% C；30～32 min，31%～36% C；32～82 min，36%～72% C；82～90 min，72%～95% C)，流速1.0 mL/min；检测波长为阿魏酸325 nm、洋川芎内酯A 280 nm、藁本内酯328 nm。
1.8 数据分析 采用DAS2.0软件，分别获得阿魏酸、洋川芎内酯A和藁本内酯3种成分的经典药代动力学参数，参照文献[5-6]按总量统计矩(相似度)法计算药代动力学总量统计矩参数，并进行比较分析。
2 结果
系統适用性与专属性考察
分别取空白血浆，加入阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯标准品溶液的空白血浆，补阳还五汤和脑健片给药后30 min的药物血浆样本，处理后上样分析。结果显示血浆中内源性物质不干扰测定，该方法专属性良好。根据前期研究结果，由保留时间和紫外光谱图确定1号峰为阿魏酸，2号峰为洋川芎内酯A，3号峰为藁本内酯[4]。
3 讨论
中药发挥药效往往取决于多种药效成分的协同作用，讲究君臣佐使配伍原则。采用传统西药药代动力学模型对中药复方药代参数进行分析，发现同一药效成分在不同药效部位、不同药材及不同配伍复方中的药代动力学特征均不尽相同。采用传统西药单一成分药代动力学模型对中药多成分在体内药代动力学行为进行评价存在一定的局限性，不能充分体现补阳还五汤类方整体成分在体内的真实代谢过程。本研究采用总量统计矩参数对经典房室模型的药动参数继续深入分析，既能反映总量药物浓度的动力学行为，又能与单个成分的统计矩参数关联，是整合多成分药物动力学较宜的数学处理方法，同时更能体现出中药多种化学成分多靶点、多途径、多环节进行整合调节的优越性。
参考文献
[1] 刘芳，刘青萍，王宇红，等.补阳还五汤及其精简方抗脑缺血损伤功效比较[J].中国中医药信息杂志，2014，21(9)：46-49.
[2] 刘芳，王宇红，蔡光先，等.补阳还五汤及其精简方(脑健片)对脑缺血大鼠海马组织CDK4/Cyclin D1表达的影响[J].中国中药杂志，2015， 40(20)：4058-4062.
[3] 夏相宜，王宇红，蔡光先，等.脑健胶囊对MCAO大鼠脑水肿、脑梗死面积及体质量的影响[J].中医学报，2014，29(4)：532-534., 百拇医药(宋亚娟)
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