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编号:12052780
脐血来源巨核祖细胞体外扩增的研究
http://www.100md.com 2009年7月1日 夏 婷 方建培 陈国华 徐宏贵 黄绍良
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    参见附件(1448KB,2页)。

     [中图分类号]R331.1

    [文献标识码]A

    [文章编号]1005-0019(2009)7-0020-02

    [摘要]目的:通过探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-3、IL-6)组合对人脐血CD34+细胞体外定向诱导扩增巨核细胞(MK)的作用,建立人脐血(CB)来源MK体外定向诱导扩增的最佳体系。方法:采用Ficoll-Hapaque分离法分离脐血的单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,在含胎牛血清的液体培养体系中、不同细胞因子组合诱导下将收集到脐血来源的CD34+细胞分别培养7、14、21天。在不同时间点进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量。结果:经过特定时间的培养,在TPO+FLT-3L+IL-6+IL-3组合中,脐血来源的CD41+细胞在培养的第14天扩增了193.23±25.24倍,均明显高于同来源的其它3组(P<0.05),达到增殖高峰。随着时间推移CD41+细胞扩增倍数均呈下降趋势。结论:证实TPO+FL+IL-6+IL-3为CB来源CD34+细胞体外定向诱导扩增MK的最佳体系。

    [关键词]巨核细胞;脐血;体外扩增

    造血干细胞移植或大剂量放、化疗的骨髓抑制期间常有一段时期的血小板严重缺乏。为了解决血小板恢复延迟,给患者回输体外扩增的巨核细胞是有效可行的[1]。脐带血(cordblood,CB)中含有大量造血干/祖细胞。近十年来,随着巨核系造血因子的分离纯化和克隆,人们已对巨核细胞体外扩增进行了深入研究,以待早日广泛应用于临床。本研究是将脐血来源的CD34+细胞体外定向诱导扩增巨核祖细胞,建立其体外扩增的最佳体系。

    1材料和方法

    1.1标本来源:CB:来自中山二院健康足月妊娠产妇经产道或剖宫产分娩之胎儿脐静脉血。每份80-100ml,共收集6份。

    1.2方法

    1.2.1CD34+细胞的分离纯化:脐血经羟乙基淀粉(hespan,6%,购自美国GIBCOBRL公司),室温下自然沉淀45分钟,吸取上清液,用磷酸缓冲液1(PBS1)调成细胞悬液加入淋巴细胞分离液中(比重:1.077g/ml,购自达科为生物技术公司)。Ficoll分离后,PBS1洗2次,再用磷酸缓冲液2(PBS2)洗涤1次。测定细胞数,并根据计数结果调细胞浓度为108/0.3ml。CD34+细胞分离试剂盒(购自德国MiltenyiBiotec公司),实验过程按说明书完成。在磁性条件下过柱分离CD34+细胞,脱离磁场充分冲洗柱子。细胞计数后,用流式细胞仪(购自美国BD公司),测定细胞分离纯度。

    1.2.2巨核祖细胞的体外扩增:将CD34+细胞浓度调整为2×104/ml,接种在24孔板中悬浮培养,每组复种3孔,每孔终体积为1ml。按细胞因子组成不同分为4组,每组细胞因子的组成和浓度一致。A.TPO+SCF+IL-6;B.TPO+SCF+IL-3;C.TPO+SCF+IL-6+IL-3;D.TPO+FL+IL-6+IL-3。细胞因子的终浓度为:IL-1、IL-3、IL-6、FL为10ng/ml,SCF为50ng/ml,TPO为20ng/ml,采用含10%胎牛血清(FCS)的IMDM。培养体系中含L-Glu(终浓度为2mmol/L)和2-巯基乙醇(终浓度为1×10-4mol/L)和适量青霉素和链霉素。将上述扩增体系置37℃、饱和湿度、CO2培养箱中培养,每3天半量换液1次,添加全量的造血生长因子,培养21天,分别测定不同时间点培养体系的总细胞数,流式细胞仪测定CD41+细胞的含量。

    1.3统计学处理:采用SPSS(V12.0)软件包处理,进行多组间one-wayANOVATest。显著性差异为p<0.05。

    2结果

    2.1脐血CD34+细胞的富集:将免疫磁珠分选纯化后的细胞用流式细胞仪检测,得到CD34+细胞含量CB是91.74±2.67%。显示富集后的CD34+细胞含量明显提高,而CD41+细胞含量仍较低,为2.45±0.70%。

    2.2脐血来源的巨核祖细胞体外扩增:在培养第7天,用流式细胞仪检测实验各细胞因子组合CB中的CD41+巨核细胞百分含量。以D组最高,为13.06%,高于A组10.60±124%、B组10.23±0.43%、C组11.46±0.51%(P<0.05),3组均较扩增前有极显著性差异(P<0.01)。D组CD41+细胞的扩增倍数为154.67±32.21,明显高于A组(61.12±13.32)、B组(47.4±10.12)、C组(59.17±32.21),具有显著性差异(P<001)。在培养第14天,各组CD41+巨核细胞所占比例较第7天减少,D组CD41+巨核细胞含量仍明显高于A、B、C3组(P<005),D组CD41+细胞的扩增倍数为193.23±25.24,明显高于A组(78.33±18.34)、B组(88.83±13.12)、C组(72.13±1248),具有显著性差异(P<0.05)。到第21天各组CD41+巨核细胞所占比例均较第14天明显下降(P<0.05),CD41+巨核细胞扩增倍数较第14天显著下降(P<0.01)。见附图。

    3讨论

    巨核细胞及血小板生成是一个多阶段的复杂,多水平调控的生物过程,这一增殖分化过程受集落刺激因子、白细胞介素等多种细胞因子的调控[2、3] ......

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