照射时间延长对小鼠Lewis肺癌凋亡影响的初步观察(2)
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1.2 主要试剂和仪器
PI染液和兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司(美国Santa Cruz Biotechno-logy公司提供)。Triton-x-100购自北京中衫金桥生物技术有限公司。Varian 23EX408高能直线加速器由青岛大学医学院附属医院肿瘤中心提供。美国BD公司出品FACSort流式细胞仪。荧光显微镜(BH-2型)为日本OLYMPUS产品。
1.3 实验方法
1.3.1 荷瘤小鼠模型的制备 将种鼠断颈处死后, 在无菌条件下分离出生长良好的肿瘤组织, 用0.9% 生理盐水洗净血性物后, 用天平称重。剪碎后按1 g肿瘤组织加入0.9% 生理盐水3 m L的比例, 经砚磨成均浆后经200目筛网过滤, 0.4%台盼蓝染色,活细胞拒染,死细胞则被染成蓝色,显微镜下计活细胞数,用生理盐水稀释为2.8×106 mL-1,制成瘤细胞悬液,将0.2mL 的瘤细胞悬液接种到健康小鼠右腹股沟皮下。接种后1 周, 肿瘤体积为(0.65±0.01) cm3, 随机分组进行实验[4]。
1.3.2实验分组荷lewis肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只随机分为假照组、常规照射组(A组)和2个IMRT模拟组(B1和B2组)4组, 10只/组。
1.3.3 照射方法 将小鼠(包括假照组小鼠) 用10%水合氯醛(350 mg/ kg)经腹腔麻醉后, 用胶布固定在固定板上,记号笔标出小鼠肿瘤体表定位,在瘤体上放1cm厚凡士林纱布补偿, 用美国Varian 23EX408高能直线加速器产生的6MV-X线垂直照射靶区,源皮距为100 cm,剂量率为6Gy/min,照射野均为2.0 cm ×2.0 cm , 总照射剂量15Gy,小鼠均在清醒状态下照射。(1) A组分3次照射,照射间隔时间1.7分钟,总时间6min; (2)B1组:分5次照射,照射间隔时间 7.0分钟,总时间30分钟;(3)B2组:分5次照射,照射间隔时间10.5分钟,总时间45分钟;各组总照射剂量相同。照射后的小鼠根据分组情况,用小鼠笼携回动物房喂养,24小时后全部小鼠脱颈处死。
1.3.4 细胞凋亡及Caspase-3的检测 剥离肿瘤组织,去除坏死组织,剪碎后70%乙醇固定,洗涤后再过滤,加入RNA酶水浴PI染色,上机检测细胞凋亡率;加入0.1%Triton-x-100,洗涤后,加入Caspase-3单抗,上机检测。
1.4 统计学方法
所有数据均用 ±s表示。采用SPSS 13.0 for windows 统计软件包,进行单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 凋亡率的检测结果
A组的凋亡率最高,为(5.26±1.74)%,假照组的凋亡率最低,为(1.02±0.25)%,B1和B2组分别为(2.92±0.18)%、(1.98±0.21)%。随着照射时间的延长,凋亡率下降,各组间差异有统计学意义,F=41.83,P<0.01。各照射组凋亡率均较假照组,差异有统计学意义,q=15.1、6.8、3.43,P<0.05。B1组、B2组与A组比较,凋亡率均降低,差异有统计学意义,q=8.35、11.7,p<0.01。B2组与B1组比较,凋亡率降低,差异有统计学意义,q=3.36,P<0.05。P<0.01。
2.2 Caspase-3的测定结果
A组的荧光强度最高,为26.54±3.07,假照组的最低,
为8.30±0.68,B1组、B2组分别为19.52±3.22、14.67±2.60。随着照射时间的延长,Caspase-3荧光强度降低,各组之间的差异有统计学意义,F=84,P<0.01。各照射组与假照组比较,荧光强度均增高,差异有统计学意义,q=21.45、13.2、7.49,P<0.01;B1和B2组与A组比较,荧光强度降低,差异有统计学意义,q=8.26、13.96,P<0.01;B2组较B1组荧光强度降低,差异有统计学意义 ,q=5.73,P<0.05。随着照射时间延长,Caspase-3有下降的趋势。
3 讨论
在传统的放疗中, 2Gy 的剂量采用3野照射总的实施时间约6 min ,而采用静态调强放疗,完成1次肿瘤量为2 Gy 的照射需要20～30 min ,甚至更长,明显长于常规治疗所需的时间, 由于机器的输出量不变,单位时间内组织的吸收剂量降低,按照经典放射生物学理论中的剂量率效应(即当剂量率下降时会增加组织和细胞对射线的抵抗性) ,这会导致肿瘤控制率下降,使生物效应明显下降[5]。Florian[6]将临床IMRT计划和常规放疗计划设计在假体上,照射到人类淋巴瘤细胞(TK6)和黑色素(Me-Wo) 细胞上,对比 2Gy 所需照射时间的不同对细胞生存带来的影响,研究结果提示, IMRT照射2Gy的时间长于常规放疗,黑色素细胞的生存率提高6% ,淋巴瘤细的生存率提高2. 2% ,提示剂量率可能直接影响IMRT的有效性 。Mu等[7] 用中国仓鼠纤维母细胞(V - 79 -379 - A) 模拟临床IMRT 照射模式分次剂量为2. 8Gy ,细胞存活曲线和修复动力学参数均由实验得出,并将其同从目前广泛使用的LQ 方程所计算的值进行比较,其研究结果显示,随分次照射时间的延长,实验所测的SF2 比率增加超过理论计算,但SF8 比率增加的理论值与实际值吻合,延长分次照射完成时间会保护DNA 快速修复的组织。Fowler[8] 的体外研究提示, IMRT照射2Gy的时间长于常规放疗,黑色素细胞的生存率提高6% ,淋巴瘤细胞的生存率提高2. 2% ,提示剂量率可能直接影响IMRT的有效性。本研究结果显示,照射时间由6min延长到30min,凋亡率明显下降;照射时间为45min时,凋亡率下降更加显著,因此照射时间延长,凋亡率下降,放射效应降低。
Caspase-3是一种半胱氨酸蛋白酶,是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶 ......
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