满洲里市计划生育服务中心对3060例孕前检查者的乙型肝炎病毒(HBV)检测结果分析
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【摘要】目的 了解孕妇乙型肝炎病毒(HBV)感染状况与新生儿宫内感染的关系。方法 ELISA法检测孕妇及部分新生儿血清乙型肝炎血清标志物(HBVM)，PCR法检测血清及外周血单核细胞(PBMC)内HBV-DNA。结果 孕妇HBV感染率为8.63%(264/3060)，HBSAg阳性率为8.19%(251/3060)。结论 孕妇中存在一定数量和程度的HBV感染,HBV宫内感染与孕妇HBeAg(+)及HBV-DNA(+)有关。
【关键词】乙型肝炎病毒 孕妇 宫内感染
中图分类号：R715.3文献标识码：B文章编号：1005-0515(2011)12-414-02
乙型肝炎病毒(HBV)感染已成为世界性公共健康难题，约有40%-50%的HBV感染由母婴垂直传播所致[1]，孕妇感染HBV后，因其特殊的生理变化，抗HBV应答与普通人存在一定差异。为探讨孕妇HBV感染状况及其与新生儿宫内感染的关系，满洲里市计划生育服务中心收住的孕妇及其分娩新生儿进行乙型肝炎血清标志物(HBVM)及HBV-DNA检测，现将结果报告如下：
1 资料与方法
1.1 研究对象
按分层抽样法筛选2009年1月-2010年12月满洲里市计划生育服务中心孕前检查者3060例，共发现HBV感染孕妇264例。 对随机选择的50例HBV感染孕妇(平均年龄24.9±2.5岁，HBeAg阳性13例)及其分娩的51例新生儿进行研究。所选孕妇肝功能检查正常，无合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染的实验室证据，无先兆流产及早产，无其它严重内外科合并症，无妊娠高血压综合征，孕期未使用过其它影响本研究的药物。
1.2 诊断标准
1.2.1 孕妇HBV感染诊断标准 孕妇HBV携带者和慢性乙型肝炎诊断符合2000年10月全国病毒性肝炎会议(西安)诊断标准。
1.2.2 宫内感染诊断标准 用胎儿断脐取血器取脐血，若HBsAg(+)及HBV-DNA(+),复查新生儿股静脉血，若仍为阳性，则判为宫内感染。
1.3 检测方法
1.3.1 HBVM检测 分批采集受检孕妇晨起空腹静脉血2ml，分娩时用胎儿断脐器自动留取脐血2ml，置灭菌Eppendorf管，常规分离血清备检。HBVM(HBsAg、抗-HBs,HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)检测参照试剂说明书，每次检测设空白、阴性、阳性对照各1孔，于酶标分析仪(450±2)nm处测定OD值，每孔测定2次，取均值。HBsAg、HBeAg、抗-HBs：P/N值≥2.1者为阳性，抗-HBe、抗-HBc：抑制率≥50%为阳性。
1.3.2 血清HBV-DNA检测 取上述备检血清，用酚：氯仿：异戊醇法提取血清模板DNA,PCR常规扩增，每次均设阳性、阴性和空白对照组个1孔。引物选自HBV核心及前C区，引物序列为上游引物P1:5′-ACTGTTCAAGCCTCGAAGCTG-3′，下游引物P2:5′-CCCGAGTCTTCTGC-3′，扩增片段长度600bp。PCR参数为预变性94℃300s，然后依次94℃30s，55℃30s,72℃30s,35次循环，最终72℃保温延伸300s。扩增产物及Marker置含EB的2%琼脂糖凝胶常规电泳，紫外投射仪下观察，出现与阳性对照在同一水平位置呈现红橙色荧光带者为阳性。
1.3.3 外周血单核细胞(PBMC)内HBV-DNA检测 分批采集受检孕妇晨起空腹静脉血及分娩时新生儿脐血各1ml,置含2%EDTA的灭菌Eppendorf管，以等量无Ca2+、Mg2+Hank′s液稀释，淋巴细胞分离液常规分离PRMC,Hank′s液洗涤3次，用1640完全培养液调整细胞数为(1-3)×109/L悬液备检，加入细胞裂解液，蛋白酶K消化，提取PBMC内HBV-DNA，余程序同血清HBV-DNA检测。
2 结果
孕妇HBV感染与宫内感染关系：随即选择50例HBV感染孕妇，分析感染状况与新生儿HBV宫内感染关系，发现HBeAg(+)、血清HBV-DNA(+)及PBMC中HBV-DNA(+)孕妇分娩新生儿宫内感染率分别为46.15%(6/13)、66.67%(8/12)、70.00%(7/10),与相应检验阴性者相比,宫内感染发生率显著增高(P<0.05或P<0.01)。(见表1)
3 讨论
本文用分层抽样法筛选满洲里市计划生育受检孕妇，发现孕妇HBV感染率为8.63%(264/3060)，HBsAg阳性率为8.19%(251/3060)。本次调查发现孕妇感染HBV有12种模式，具有一定的复杂性和多样性。以“小三阳”最多见，占受染孕妇总数的35.98%(95/264)，“大三阳”并非少见，占16.67%(44/264)。
对50例孕妇感染状况与其分娩的51例新生儿宫内感染情况分析，发现新生儿宫内感染率与孕妇的HBeAg(+)、血清和PBMC中HBV-DNA(+)密切相关。HBV-DNA和HBeAg(+)是HBV传染性的指标。HBV感染可以HBsAg抗原-抗体复合物形式，由分布于滋养层细胞和绒毛间质细胞的FcγRⅢ受体介导而引起胎儿感染。HBeAg是可溶性抗原，以游离态和结合态(IgG)存在，结合态HBeAg可与胎盘上IgG受体结合侵入胎儿血循环。本次调查发现新生儿脐血HBV-DNA的检出率较HBsAg检出率高，提示PCR法较ELISA法有更高的敏感性或HBV病毒存在一定程度S区变异。胎儿和新生儿免疫细胞尚未成熟，当其受HBV抗原物质，尤其是小分子量HBeAg直接刺激和诱导时，Th细胞可发生免疫耐受，导致被感染胎儿或新生儿的CTL杀伤力降低，B细胞分泌特异性抗体减少 ......
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