血管紧张素转换酶基因多态性分布与尘肺的关系(1)
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【摘要】目的 为探讨血管紧张素转换酶基因多态性分布与尘肺的关系。方法 Ⅱ、Ⅲ期尘肺组30例，Ⅰ期尘肺组33例，接尘无尘肺组31例，健康对照组35例，各组均为男性。采集静脉血，PCR方法检测血管紧张素转换酶(ACE)基因。结果 Ⅱ、Ⅲ期尘肺组ACE基因Ⅱ型10例，占33.3%，ⅠD型16例，占53.3%，DD型4例，占13.3。等位基因频率Ⅰ：56.5%，D:43.5%。Ⅰ期尘肺组Ⅱ型8例，占24.2%，ⅠD型17例，占51.5%，DD型8例，占24.2%。等位基因频率Ⅰ：50.0%，D:50.0%。四组间基因分布频率及等位基因分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 尘肺患者ACE等位基因频率分布与我国汉族人群分布基本一致，血管紧张素转换酶基因多态性分布与尘肺没有明显关系。
【关键词】尘肺 血管紧张素转换酶 基因多态性
中图分类号：R135.2 文献标识码：B 文章编号：1005-0515(2012)2-048-03
肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)对血压、血流和机体内环境的调节起着非常重要的作用，RAS主要由肾素(Renin)、血管紧张素原(Angiotensinogen,AO)、血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ，AngⅠ)、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)组成。据报道，血管紧张素转换酶基因对心血管系统疾病和内分泌系统疾病的发生有一定影响[1]，同时与肺部疾病的发生有关[2]。为探讨血管紧张素转换酶基因多态性与尘肺的关系，作者进行了本次研究，现将研究内容报告如下：
1 对象与方法
1.1 对象 选择2007年乌海市职业病防治院住院的63例尘肺患者为尘肺组，尘肺的诊断分期依据我国《尘肺诊断标准》(GBZ70-2002)，均为男性，其中Ⅰ期尘肺33例，Ⅱ期尘肺24例，Ⅲ期尘肺6例。另选与尘肺患者组年龄、性别相匹配的31例有粉尘接触史，但无尘肺表现的当地煤矿工人为接尘无尘肺组。同时将乌海市疾病预防控制中心35例健康检查者(无粉尘接触史)为对照组，要求对照组人群既往无肺部疾患、高血压、冠心病、脑血管疾病、糖尿病及肾病等病史。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器与试剂 XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)，高速离心机 (TGL—16B 上海安亭厂)，电泳仪(DF-D 北京六一仪器厂)，紫外反射透射分析仪 (KH-UVⅢ型 上海康禾光电有限公司)，Taq 酶、10×buffer、引物、DNA缓冲液(上海生物工程有限公司)，DNA裂解液由包头医学院基因诊断研究所提供。
1.2.2 PCR法基因扩增和ACE基因型判定
⑴ DNA的制备
① 枸橼酸钠抗凝的冻存血室温放置自然融化后取50ul加到1.5ml的EP管中，加双蒸水至1ml，混匀，室温静置15分钟后3000rmp离心2分钟，弃上清留残液。
② 向1.5ml的EP管中加裂解液60ul，震荡器上剧烈震荡约1分。
③ 沸水煮10分钟，冰水冷却约5分，再次震荡1分钟。
④ 11500rmp高速离心4分钟，取上清液做DNA模板。
⑵ 引物合成
普通PCR引物(上海生物工程公司合成)参照文献设计
-正向引物：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’
-负向引物：5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’
插入序列特异性PCR的引物(上海生物工程公司合成)参照文献设计
-正向引物：5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3’
-负向引物：5’-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3’
⑶ PCR反应体系(含普通PCR和插入序列特异性PCR)
12.5ul的总反应体系：
4×dNTP 0.25ul(10Mm )
10×buffer 1.25ul
primer--1 0.175ul
primer--2 0.175ul
Taq 酶(2U/ul) 0.5ul
DNA模板 2 ul
双蒸水加至12.5ul
扩增程序
普通PCR：预变性为94oC 2min，变性94oC 25s，退火58 oC 35s，延伸72℃45s，35个循环，终末延伸72oC 10min。
插入序列特异性PCR：预变性94oC 2min，变性94oC 25s，退火78 oC 35s,延伸72 oC 45s，35个循环，终末延伸72oC 10min。
⑷ 产物鉴定与分析
取PCR产物10ul，加入含溴乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳(100V，25min)，紫外灯下观察出现条带数目确定ACE基因型，若只有190bp扩增带者为缺失纯合型(DD型)，只有490bp扩增带者为插入纯合型(lI型)，190bp和490bp扩增带并存者为插入、缺失杂合型(ID型) ......
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