一起甲型H1N1流感疫情实验室检测结果分析(1)
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【摘要】目的 针对35名甲型H1N1流感疑似病例进行实验室检测，并根据检测结果对这起甲型H1N1流感疫情进行分析；对real-time RT-PCR方法、鸡胚分离方法的灵敏度进行统计学检验。方法 应用real-time RT-PCR方法、RT-PCR方法、鸡胚分离方法等实验室检测方法对35例甲型H1N1流感疑似病例的标本进行检测；配对设计资料的卡方检验。结果 35例甲型H1N1流感疑似病例中，甲型H1N1流感确诊病例共27例，阳性率为77.14%；对real-time RT-PCR方法、甲型H1N1流感病毒的鸡胚分离方法灵敏度进行统计学检验，差异有统计学意义，可以认为real-time RT-PCR方法灵敏度高于鸡胚分离法灵敏度。结论 此次甲型H1N1流感疫情属于暴发流行，是由于学生开学返校，集体生活引起聚集性群体性发病且无保护性抗体而引起，二代病例发病较多，反映此次甲型H1N1流感传染性较强；根据实验室检测数据可以认为real-time RT-PCR方法的灵敏度高于鸡胚分离法的灵敏度。
【关键词】甲型H1N1流感病毒 暴发 输入性病例 二代病例
中图分类号：R181.8；511.7 文献标识码：A 文章编号：1005-0515(2012)3-330-03
流感病毒分为：甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)，甲型症状较严重，容易造成大流行；乙型症状较不严重，可造成大流行；丙型症状轻微，较少造成大流行。本次流感为一种新型呼吸道传染病，其病原为新甲型H1N1流感病毒，病毒基因中包含有猪流感，禽流感，人流感三种流感病毒的基因片段。甲型H1N1流感病毒属于正粘病毒科，甲型流感病毒属。典型病毒颗粒成球状，直径为80-120nm，有囊膜，囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是红细胞血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)和基质蛋白M2，病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm，为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。病毒对乙醇，碘伏，碘酊等敏感，对热敏感，56℃ 30分钟可灭活。甲型H1N1流感潜伏期一般为1-7天，多为1-4天，通常表现为流感样症状，包括：发热，咳嗽，咽痛，咯痰，流涕，鼻塞，头痛，全身酸痛，乏力，部分病例出现呕吐和腹泻，可伴有眼部充血和扁桃体肿大，可发生肺炎等并发症，少数病例病情进展迅速，出现呼吸衰竭，多脏器功能不全或衰竭，患者原有的基础疾病亦可被诱发加重，呈现相应的临床表现，病情严重者可导致死亡。甲型H1N1流感患者为主要传染源，无症状感染者也具有传染性。甲型H1N1流感主要通过飞沫经呼吸道传播，也可通过口腔，鼻腔，眼睛等处粘膜直接或间接接触传播，接触患者的呼吸道分泌物，体液和被病毒污染的物品亦可能引起感染[1]。由于甲型H1N1流感病毒属于一种新型呼吸道传染病毒，人体不具有保护性抗体，因此人群普遍易感。本病传播迅速，常呈地方性流行或大流行。
1 对象与方法
1.1 研究对象
从2009年9月15日至10月15日某大学某学院发生的112名疑似甲型H1N1流感病例中随机抽取的35例疑似病例作为研究对象。
2 研究方法
2.1 抽样方法—分层抽样
分层抽样是指先将总体按某种特征分为若干次级总体(层)，然后再从每一层内进行单纯随机抽样，组成一个样本。该院分A、B、C、D四个系，从每个系中根据单纯随机抽样的方法抽取共35例疑似病例进行采样，获取标本并进行实验室检测。
2.2 实验室检测方法
按照国家卫生部出台的《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案(试行)》[2]，应用real-time RT-PCR方法、RT-PCR方法、鸡胚分离方法等实验室检测方法对35例疑似病例的标本进行检测。
2.2.1 标本的采集
采集35例疑似病例的咽拭子标本，置于无菌采样夜2~3ml中，立即用冰块或冰排保存或置于4℃(冰箱)，并马上送至实验室进行甲型H1N1流感病毒的病原学检测，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。如不能立即试验应保存在-70℃或-70℃以下，不应保存在-20℃。
2.2.2 核酸检测的材料及仪器
2.3 材料
RNA 提取试剂盒：QIAGen RNeasy Mini Kit
逆转录试剂盒：QIAGEN One step RT-PCR Kit
real-time RT-PCR试剂盒：Super ScriptIMⅢ Platirum One step Quantitative
RT-PCR System
RT-PCR试剂盒：QIAGEN One step RT-PCR Kit
2.4 仪器。
冷冻高速离心机、漩涡振荡器、实时荧光定量PCR仪、PCR仪、凝胶成像仪、电子天平(1/1000)
2.5 甲型H1N1流感病毒的核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。RT-PCR原理是以RNA 为模板经逆转录产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR 扩增以检测目的基因的表达情况。甲型H1N1流感病毒的核酸检测方法包括real-time RT-PCR方法和RT-PCR方法。
2.6 病毒RNA的提取
取咽拭子标本100ul置于1.5ml灭菌离心管中，采用QIAGen RNeasy Mini Kit操作说明提取RNA。取5ul总RNA进行逆转录，其余保存于-70℃。
2.7 real-time RT-PCR检测方法
real-time RT-PCR检测方法检测甲型H1N1流感是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的甲型H1N1流感病毒进行定性检测鉴定。引物和探针序列为美国CDC设计，引物和探针序列如下表：
本实验在BSL—2实验室内进行，所有样本操作均在生物安全柜(BSC)内进行，遵循生物安全三级个人防护。
2.8 RT-PCR检测方法
RT-PCR检测方法的引物序列为国家流感中心设计，引物如下表：
RT-PCR产物的检测采用琼脂糖凝胶电泳技术，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，时间40min，用凝胶成像分析系统分析相应PCR产物的条带 ......
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