辣根过氧化物酶逆行示踪的实验研究
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2010年11月1日
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[摘要]目的建立神经逆行示踪的动物模型。方法将辣根过氧化物酶经大鼠右侧肱二头肌注入，两天后取材进行组织化学反应。结论辣根过氧化物酶可作为一种神经逆行示踪的方法。
[关键词]辣根过氧化物酶; 神经示踪
[中图分类号] R392[文献标识码]A [文章编号] 1005-0515(2010)-10-001-01
THE ANIMAL MODEL OF HORSERADIS PEROXIDASE NERVE RETROGRADE TRACT-TRACING
LIUMingzhong，ZHANGWenming SHIJianhui,LUTianxiang,WUShanpeng.
(Department of Orthopedics,the First Hospital of Quanzhou，Quanzhou Fujian，362100，P.R.China；
Department of Orthopedics,the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,fuzhou Fujian, 350005)
[Abstract]ObjectiveTo establish the animal model of nerve retrograde tract-tracing.MethodsHorseradis peroxidase is injected to the rat through the right bicipital muscle,then take the material to conduct histochemical reaction after two weeks.Conclusion Horseradis peroxidase can be used to the nerve retrograde tract-tracing.
[Keywords] Horseradis peroxidase;nerve retrograde tract-tracing
辣根过氧化物酶(HRP)是一种含血红素基的植物糖蛋白，肌肉内注射可由肌肉神经末梢吸收，逆向运至胞体，到达一定部位后可以用组织化学的方法显示出来。1971年Krisenson等及1972年Lavail等先后将HRP用于追踪周围神经及中枢神经的纤维联系，创造了HRP追踪技术。本文在参考前人经验的基础上，综合文献，重建神经逆行示踪的动物模型。
1 实验设计
1.1 实验动物 动物选用健康成年清洁级SD大鼠20只(由福建医科大学实验动物中心提供)，体重200～250g，雌雄不拘，行经右侧肱二头肌注入辣根过氧化物酶。
1.2 仪器显微镜显微外科手术器械电子天平
1.3试剂肝素钠生理盐水(0.25mg/100ml)，1%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲液(PH7.4)， 10%蔗糖， HRP 粉剂(厦门星隆达公司提供)，四甲基联苯胺(TMB)，无水乙醇，钼酸铵，硝普钠，0.1mol/l 醋酸盐缓冲液(pH3.7 )，30% 双氧水(H2O2)
2 实验步骤
2.1 动物模型的建立大鼠以2%的氯胺酮(80-100 mg/公斤体重)腹腔注射麻醉，备皮，仰卧固定于手术台上，术野消毒，在16倍手术显微镜下操作，沿右锁骨下做2-3cm横切口，分离切开皮肤，皮下组织，沿胸大肌﹑胸小肌的肌纤维走向钝性分离，用自制的小拉钩分别向上、下牵开肌肉,显露暴露肱二头肌(见图1)，电子天平称其30mgHRP 粉溶于0.1ml蒸馏水中，暴露肱二头肌，注入30%HRP溶剂5μl，关闭切口。存活48小时。
图1
2.2 灌注固定 动物麻醉同前，开胸，经左心室-主动脉插管，灌注温的(37℃)肝素钠生理盐水，冲洗血液至液体清亮，约100 ml，同时切开右心房放血。 再灌注冷的固定液(1%多聚甲醛-1.25%戊二醛的0.1mol/l磷酸盐缓冲液，PH7.4， 4℃)，约500ml ,30分钟。灌注后用含10%蔗糖的0.1mol/l磷酸盐缓冲液100ml冲洗总时间亦为30min。
2.3取材随后在放大16倍手术显微镜下，将大鼠C6节段脊髓取出(见图2)，组织块放入含25%蔗糖的0.1mol/l磷酸盐缓冲液于4℃冰箱过夜。
图2
2.4 切片 待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切脊髓，厚15-20um，贴于多聚赖氨酸载玻片上，回至室温凉干或烘干 。
2.5 呈色反应
2.5.1 组织片用双蒸水冲洗后在孵育液中避光预反应20min。(孵育液由A液和B液混和而成，A 液：5mgTMB溶于2.5ml无水乙醇中；B 液：100mg 硝普钠溶于92.5ml0.1mol/l 醋酸盐缓冲液中。
2.5.2 在孵育液中加入30% H2O2 50μl，避光孵育20min。并用0.01mol/l 醋酸盐缓冲液洗6次×5min。
2.5. 3在钼酸铵溶液(钼酸铵溶液：5g 钼酸铵溶100ml0.1mol/l醋酸盐缓冲液中)中复染20min。并用0.01mol/l醋酸盐缓冲液洗6次×5min。
2.6 封片 切片经蒸馏水漂洗30s，再用70%、80%、95%酒精逐级脱水各1min，二甲苯透明两次，共4-10min，树胶封片。
3 结果(见图3)
HRP在双氧水存在的条件下，与TMB反应呈蓝黑色，从而将标记神经元及其突起显现出来。根据图3所示，HRP逆行标志神经元胞体呈蓝黑色，背景呈白色，神经元胞体结构清晰，通过本实验说明HRP可作为一种神经逆行示踪的方法。
4讨论
4.1常用神经示踪材料有：辣根过氧化物酶、荧光材料、生物素葡糖聚胺等，辣根过氧化物酶是最早应用于神经示踪的材料，为了提高辣根过氧化物酶法的灵敏度, Mesulam 用TMB作为辣根过氧化物酶的成色剂,增强了辣根过氧化酶法的灵敏度[1]。
4.2文献报道大鼠臂丛神经在结构及功能上与人类臂丛神经极为相似，肌皮神经从外侧束发出后，行走于臂丛神经外侧进入肱二头肌，全长2cm左右，其解剖位置恒定；肱二头肌也是长短两头，起止点及功能与人类相同，仅受肌皮神经支配，其肌皮神经脊髓灰质运动核团主要定位于颈髓C6 节段[2] ......
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