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编号:12151711
80430极低频率电磁场对肝癌细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响(1)
http://www.100md.com 2011年11月1日 张琰 汤唯艳 朱华云 寇莹莹 刘宇飞 吴剑秋
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    参见附件(2606KB,2页)。

     [摘要] 目的 研究极低频率电磁场(Extremely Low Frequency Electromagnetic Field,ELF)对肝癌细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响,探索ELF在治疗肝癌中的作用。方法 以正常的肝细胞L-02为对照,通过Real-timePCR和流式细胞仪(FCM)方法检测经过ELF处理过的肝癌细胞系BEL-7402的Bax和Bcl-2基因表达情况。结果 经ELF处理后BEL-7402细胞Bax基因表达明显上升,而Bcl-2基因表达显著下降,对L-02细胞则没有影响。结论 ELF能够上调促进凋亡基因Bax在肝癌细胞中的表达、下调抑制凋亡基因Bcl-2的表达,提示EMF促进肝癌细胞凋亡方面具有重要作用,为EMF在临床治疗肝癌提供了线索。

    [关键词] 肝细胞癌; BAX; bcl-2; 基因表达; 凋亡

    [中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515(2011)-11-046-02

    肝细胞癌(HCC)为原发性肝癌,在我国是最常见的恶性肿瘤之一,目前临床上仍然没有什么有效的治疗方法。极低频率电磁场(ExtremelyLowFrequencyElectromagneticField,ELF)是一种新兴的治疗肿瘤的方法[1],已经有报道显示,ELF对于许多恶性肿瘤都有一定的治疗效果,但是ELF治疗恶性肿瘤的机制,特别是分子机制不甚明了[2-5]。本研究试图通过分析ELF对肝癌细胞系BEL-7402和正常肝细胞系L-02中Bax和Bcl-2基因表达的影响,揭示ELF对肝癌细胞凋亡相关基因影的表达响,从而探寻ELF在肝癌治疗方面的分子机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 标本 肝癌细胞系BEL-7402以及正常肝细胞L-02购自sigma公司。

    1.1.2 RNeasyMiniKit试剂盒 购自QIAGEN公司产品,Bax、Bcl-2、β-actin引物购自南京金思特科技有限公司,RT试剂盒购自Tiangen公司,Real-timePCR试剂盒购自Tiangen公司,鼠抗人Bax和Bcl-2抗体购自sigma公司。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养的方法 用含10%胎牛血清,100U/ml的青霉素,100U/ml的链霉素的RPMI-1640培养液中,置37℃,饱和湿度5%的CO2培养箱中培养,传代,当细胞生长活力良好时使用。

    1.2.2 EMF对肝癌细胞的处理 低频率电磁场由武汉市海军工程学院提供(型号:DL—D03)。额定电压220V,单相频率100Hz,由可调变压器及电阻调节输出磁场强度。将肝癌细胞系BEL-7402与胎肝细胞(L-02)接种到孔板中,并置于磁场强度分别为0.9mT的磁场中进行干预,每天刺激2次,每次1h,作用3天。

    1.2.3 总RNA提取、纯化与RT-PCR 按说明书用TRIzol提取肝癌细胞系BEL-7402与正常肝细胞L-02中的总RNA,通过紫外分光光度计检测RNA的产量并检测RNA的纯度。以此RNA为模板,70℃灭活10min,加入10mmol/Loligo(dT)18,dNTP以及AMV逆转录酶,5xAMV逆转录酶缓冲液等,合成cDNA。然后加入Bax,Bcl-2,β-actin引物,分别进行PCR扩增。Bax上游引物序列:5’一CGGCGAATTGGAGATGAA一3’;下游引物序列:5’一GTGTCCACGTCAGCAATCAT一3’;Bcl-2上游引物序列:5’一CATGCCGTCCTTAGAAAAATACA一3’;下游引物序列:5’一CTGCTTTTTATTTCATGAGGTACATT一3’;β-actin上游引物序列:5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′;下游引物序列:5-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR扩增条件:94oC预变性2min,然后94℃3Osec,55oC40sec,72oC30sec共40个循环,最后72oC10min。以6ul扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,β-actin检测逆转录效率,以凝胶成像系统摄像并分析。

    1.2.4 FCM检测 Bax和Bcl-2蛋白的表达:收集ELF作用后的细胞,70%冷乙醇固定2h,PBS洗涤2次,鼠抗人Bax和Bcl-2单克隆抗体室温固定30min,PBS洗涤2次,加入二抗为FITC标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG避光染色30min。同时设阴性对照用PBS代替一抗和二抗,同型对照组只加入二抗。流式细胞仪测定荧光强度。以荧光指数(FI)表示蛋白的表达情况,FI=(样本蛋白荧光强度-同型对照的荧光强度)/正常对照的荧光强度。

    1.2.5 统计学处理 用SPSS11.5统计软件进行统计学分析,结果中的定量数据用均数±标准差(x±s)表示,两组均数间比较采用t检验,样本间率的比较采用Fisher精确概率法计算X2值(双侧)。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 Real-time-PCR检测 Bax和Bcl-2基因表达结果。Real-timePCR的结果可以看到:各组实验样品的扩增曲线见图1;各组实验样品的溶解曲线见图2。BEL-7402细胞经过ElF处理后,与未处理组相比较,Bax的表达明显上升:由0.09852±0.003117升高至0.169676±0.004860(P<0.05);Bcl-2的表达明显下降:由0.091253±0.003849降低至0.052458±0.002457(P<0.05)图3;

    图1 样品扩增曲线

    图2 样品溶解曲线

    图3 ELF对肝细胞Bax及Bcl-2表达的影响

    2.2 FCM检测 Bax和Bcl-2蛋白表达的结果:ELF处理后,L-02细胞Bax和Bcl-2蛋白表达无明显差异,而BEL-7402细胞Bax和Bcl-2蛋白表达有明显的下降(P<0 ......

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