兔椎间盘退变过程中软骨终板TNF-α表达及作用机理探讨(2)
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参见附件(2811KB，2页)。
1.1.2 组织学观察 处死动物后，取出腰椎间盘，置于4%多聚甲醛溶液固定48h。15%EDTA溶液脱钙，EDTA溶液量是固定组织的20倍左右，置于37℃温箱内，每周换液一次。行梯度酒精脱水，浸蜡包埋。切取椎间盘矢状面切片，片厚5μm，进行HE、甲苯胺蓝染色，观察软骨终板形态的变化。在日本OlympusBXDX光学显微镜观察。
1.1.3 软骨终板TNF-α测定 处死动物后，立即在无菌操作下取出L3～4椎间盘。将软骨终板置于24孔培养板内，在37℃，5% CO2条件下，用含10%胎牛血清的DMEM2ml培养，72h后取上清液，集中待测。待全部标本收集完全后，按放免检测试剂盒说明书操作，测定TNF-α含量，TNF-α结果以ng/ml表示。TNF-α检测试剂盒由北京解放军总医院放免研究所提供。
1.2 TNF-α对培养终板软骨细胞蛋白合成的影响 5只长枫杂交猪，雄性，体重18-20kg，静脉注射2%戊巴比妥钠1.5ml/kg麻醉、无菌操作下软骨终板取材培养，将生长状态良好的第二代软骨终板细胞传代[4]。软骨终板细胞接种于24孔培养板内，待细胞进入亚融合状态后，每孔加入含5%的胎牛血清的DMEM培养基培养1.5ml，分组为空白对照组，TNF-α组(终浓度为50ng/ml，英国PeproTech公司产品)，每组复设12孔。培养24小时后，有6孔每孔加入5μCi/mlNa235SO4培养12小时，闪烁计数仪计数，结果以cpm表示，以35S掺入法检测蛋白多糖合成。另6孔每孔加入1μCi/ml3H-脯氨酸培养24小时。闪烁计数仪计数，结果以cpm表示，以3H-脯氨酸掺入法检测胶原合成。
1.3 统计学分析 数据以x±S，采用配对t检验，以SPSS10.0软件包进行统计学处理。P<0.05认为有显著性差异。
2 结果
2.1 软骨终板退变的组织学观察 软骨终板由透明软骨组成，周边较厚而中央较薄，软骨终板外侧与椎体松质骨紧密接触，可见毛细血管分布，中央部血管芽较多且较膨大，周边部血管芽较少且较细小。12w，实验组软骨终板较对照组明显变薄，细胞层数减少，细胞数亦减少，血管芽周围钙化，包裹血管芽大部分，血管芽数目减少。24w，实验组软骨终板明显变薄，细胞外基质相对减少，软骨终板细胞数目减少，血管芽变细，完全被钙化软骨包绕，不与软骨终板直接接触。36w，软骨终板变得更加菲薄，软骨终板细胞明显减少，血管芽与软骨终板之间有一薄层钙化软骨。
2.2 软骨终板TNF-α含量的测定 随着动物退变模型时间的延长，实验组与对照组中TNF-α含量均升高，且实验组明显比对照组高(P<0.05)；对照组组内各时间段的TNF-α含量亦有显著性差异(P<0.05)；但实验组中36w时TNF-α含量比24w时的含量增加不显著(P=0.21)，见表1。
表1 软骨终板中TNF-α含量比较(ng/ml,x±S,n=4)
*表示实验组与对照组比较(p<0.05)，▲表示对照组组内比较(p<0.05)，#表示实验组中各组与12w比较(p<0.05)，Δ表示36w实验组与24w实验组比较(p>0.05)。
2.3 TNF-α对培养终板软骨细胞蛋白合成的影响 软骨终板细胞需要摄入35S和3H-脯氨酸用于糖胺多糖和胶原的合成，因此，通过测定35S和3H-脯氨酸摄入量的多少，即可反应基质蛋白多糖及胶原的合成量。结果显示，TNF-α处理组产生的蛋白多糖和胶原合成量，与对照组之间的差别均有显著性意义(P<0.01)，说明TNF-α能显著减少蛋白多糖和胶原合成量，见表2。
表2 TNF-α处理后蛋白多糖和胶原合成量的比较(x±S)
*处理组与对照组相比P<0.01。
3 讨论 椎间盘退变性疾患是人类最常见的疾患，发病率高，病程长，属于祖国医学的“腰痛”、“腰腿痛”范畴。早在《素问》中就提到：“衡络之脉令人腰痛，不可以俯仰，仰则恐仆，得之举重伤腰”。病因多为外受伤损，内有亏虚或感受风寒湿邪，痹着日久，致肝肾亏损，气血不足，可分为气滞血瘀、风寒痹阻、湿热痹阻、肝肾亏虚等型。治宜祛风寒、止痹痛、益肝肾、补气血，祛邪扶正兼顾。中药验方独活寄生汤很早被应用于中医“腰痛”的治疗，并获得良好的效果。该方出自我国医圣孙思邈的《备急千金要方》，云“治腰背痛，独活寄生汤。夫腰背痛者，皆犹肾气虚弱，卧冷湿当风所得也……”。该方由独活、寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、人参、甘草、当归、白芍、地黄组成。方中用独活、秦艽、防风祛风湿以止痹痛；杜仲、牛膝、寄生补益肝肾，兼祛风湿；人参、茯苓、甘草益气；当归、地黄、白芍、川芎补血和血；细辛温经散寒、祛风止痛，肉桂温通血脉。全方具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效，主治风寒湿痹症，属于肝肾两亏、气血不足者。诸药合用，标本兼顾，扶正祛邪，使风寒湿三气得除，气血得充，肝肾得补，则诸症可解。该方广泛应用于脊柱退变性疾患以及骨关节病的治疗，已证明具有一定的疗效[5]。
增龄和失稳均可以导致椎间盘退变。椎间盘退变是个非常复杂的过程，其机制并没有很清楚，尤其是何者为始动因子，何者是中间环节等，更是众说纷纭。但是研究已经表明，椎间不稳可以导致椎间盘退变加速，而在这个退变过程中，炎性因子发挥重要的作用。
TNF-α是一种很强的炎性因子，其不但可以刺激疼痛感受器，而且对骨软骨代谢均有影响。本实验表明其对培养终板软骨细胞具有抑制蛋白多糖和胶原合成的作用。而蛋白多糖和胶原合成是组成软骨细胞外基质的主要成分，这种软骨基质合成的障碍就影响了正常软骨功能，就可以出现软骨细胞功能变化如调亡等，导致软骨终板退变。
本研究表明，制模后经12-36w时间可诱发了软骨终板退变，而且实验组的TNF-α表达明显高于对照组。而随着时间延长，对照组内TNF-α表达也明显增加，这可能是增龄的影响，因为增龄同样可以引起椎间盘软骨终板的退变，只是过程没有那么迅速。但是实验组24w与36w之间TNF-α无显著性差异，其原因可能是，在退变早期，TNF-α表达增加，会加速软骨终板退变，而进入软骨终板退变后期，由于软骨钙化或者骨化加重，细胞成分减少，TNF-α表达就不会明显增加，甚至有可能还会出现下降，只是本实验仅观察到36w，是否确实如此，尚需要研究证实。这可能说明作为炎性因子，其表达和发挥作用可能处于椎间盘退变的早期，这也说明我们对椎间盘退变的干预存在时效性问题。也就是干预针对炎性因子的干预环节应早期进行，方能有效。
采用现代实验技术研究独活寄生汤的作用机理很有意义，但存在不少困难。刘英杰[1]等采用兔膝关节腔内注入木瓜蛋白酶造成骨关节炎的病理模型，以本方浓缩液喂食饲养，结果发现本方可以减少IL-1β及TNF-α的含量，治疗1周后抑制作用逐渐明显，3周时达高峰，证实本方对膝关节骨性关节炎有治疗作用，这种作用可能是通过抑制炎症因子来实现的。但也有实验表明，独活寄生汤对对骨关节炎动物模型关节液中细胞因子IL-1β、TNF-α水平无显著性影响，但透明质酸钠、硫酸氨基葡萄糖、塞来昔布等均有明显作用[6]。这也说明中医方药研究中 ......
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