RP-HPLC法测定注射用去甲斑蝥酸钠的含量及有关物质
【摘要】目的:建立高效液相色谱法测定注射用去甲斑蝥酸钠的含量及有关物质。方法:色谱柱为ODS-C18柱(4.6×200mm, 5μm)，流动相为乙腈-0.01mol•L-1磷酸二氢铵溶液(8:92，磷酸调节pH3.1)，检测波长为211nm。结果:去甲斑蝥酸素浓度在0.25～4.0mg•mL 范围内线性关系良好，r=0.9997，两种制剂规格的平均回收率为分别为99.48%和99.63%,RSD分别为0.62%和0.44%。 结论:该方法结果准确，适用于注射用去甲斑蝥酸钠的质量控制。
【关键词】注射用去甲斑蝥酸钠；含量测定；有关物质
【中图分类号】R485 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)06-0413-02
去甲斑蝥酸钠是一种抗肿瘤药物，由去甲斑蝥素与氢氧化钠反应制得。去甲斑蝥酸钠临床用于肝癌、食管癌、肺癌等的书签用药或联合用药，能够干扰癌细胞的分裂，抑制癌细胞DNA合成，但对正常骨髓细胞不抑制，并能升高白细胞[1]。在去甲斑蝥酸钠注射液的国家标准中[2]，采用在外分光光度法进行含量测定，以去甲斑蝥素为对照品。注射用去甲斑蝥素尚无国家标准，本文则采用RP-HPLC法对注射用去甲斑蝥酸钠的含量及有关物质进行了测定。
1 仪器与试药
日立L2000高效液相色谱仪；注射用去甲斑蝥酸钠(自制，规格：10mg/支)；去甲斑蝥素对照品；磷酸二氢铵(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；乙腈(天津康科德化工有限公司)；磷酸(分析纯，天津市博迪化工有限公司)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:通过酸、碱、氧化、热、光破坏试验，确定一下色谱条件，在该条件下，所有降解产物色谱峰与主成分色谱峰分离度良好。
色谱柱：ODS-C18柱(4.6× 200mm，5μm)；流动相为乙腈-0.01mol•L-1磷酸二氢铵溶液(8:92，磷酸调节pH3.1)，检测波长：211nm；流速：1.0mL•min-1；柱温为35℃，进样量为20μL。
2.2 专属性考察:①取流动相20 μL注入液相色谱仪，结果表明流动相不干扰有关物质的检查。②取辅料适量，加流动相适量使溶解，摇匀，滤过；取滤液20 μL注入液相色谱仪，结果表明辅料无干扰。
2.3 定量限:取去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL-1的对照品溶液1mL，加水稀释至100mL，进样20μL测定，确定定量限为2.1μg。
2.4 标准曲线的绘制：对照品溶液：取去甲斑蝥素对照品约50mg,精密称定，置10mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液适量置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，配制成含去甲斑蝥素对照品0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg•mL 的溶液，分别精密量取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程A=474766C，r=0.9997。去甲斑蝥素质量浓度在0.25～4.0mg•mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验:为考察方法的精密度，取同一份去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL 的对照品溶液20μL，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.18%。
2.6 稳定性试验：取去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL 的对照品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，10h取20μL进样，测得峰面积的RSD为0.71%，说明溶液室温放置在10h内稳定。
2.7 回收率试验：按处方量的80%，100%和120%进行回收率试验。分别取去甲斑蝥素对照品适量(约80，100，120mg)，精密称定，然后按处方比例加入辅料，加流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果表明低、中、高三种浓度的回收率(n=3)分别为100.3%，99.4%和99.2%，平均回收率(n=9)为99.63%，RSD为0.62%。说明选取的高效液相色谱法准确度良好。
2.8 含量测定：取自制样品，倾出内容物，精密称定(约相当于去甲斑蝥素10mg)，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取对照品约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别去上述溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果表明三批样品的含量分别为101.7%，101.7%，101.8%。
2.9 有关物质测定:
2.9.1 测定方法:取装量差异项下的本品适量，精密称定(相当于去甲斑蝥素20 mg)于10mL量瓶中,加流动相稀释制成每1mL中约含去甲斑蝥素2mg的溶液作为供试品溶液；精密量取2 mL于100mL量瓶，加流动相制成每1mL中含40μg去甲斑蝥素的溶液，作为对照溶液。以高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)测定，精密量取对照溶液20μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，记录时间为去甲斑蝥素保留时间的3倍。在供试品溶液色谱图中，所有杂质峰面积之和，不得大于对照溶液的主峰面积。测得三批样品的有关物质量为0.92%，0.84%，0.93%。
3 讨论
由于目前仍无注射用去甲斑蝥酸钠的国家标准，根据去甲斑蝥酸钠注射液的相关标准，采用乙腈-0.01mol•L 磷酸二氢铵溶液(8:92，磷酸调节pH3.1)为流动相，系统色谱峰对称性良好，保留时间在7.1min左右，能使主峰与酸、碱、氧化、高温破坏产生的降解产物分离。潘正[3]等人曾报道C18柱对去甲斑蝥酸钠的保留能力较差，可能是由于他们测定的是去甲斑蝥酸钠冻干粉针，该制剂的辅料对C18柱的保留能力产生了一定的影响。陈杰[4]等曾经用HPLC法测定注射用去甲斑蝥酸钠含量与有关物质，流动相为0.02 mol•L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(75:25)，采用DAD检测。本法pH与其接近，但用乙腈代替甲醇，降低了有机相用量；采用紫外分光光度法，使主峰与破坏后的降解产物峰和杂质峰都得到了良好的分离。本法对三批样品进行了检验，结果有关物质均不大于1.0%。本法方便、准确，可以用作注射用去甲斑蝥酸钠的质量控制方法。
参考文献
[1] 李柏, 凌昌全. 去甲斑蝥素基础及临床研究进展[ J ]. 中草药, 2002, 33(2) : 184-185
[2] 国家药典委员会.国家药品标准(三册)[S]. 北京：人民卫生出版社，2002: 62
[3] 潘正, 付侃, 付晓泰. RP-HPLC法测定去甲斑蝥酸钠冻干粉针的含量[J]. 中国药物应用与检测, 2009, 6 (4): 215-217
[4] 陈杰, 李展. HPLC法测定注射用去甲斑蝥酸钠含量及有关物质[J]. 中国药品标准, 2007,8(2):56-58
作者单位：110024 沈阳兴齐制药有限公司1
110016 沈阳药科大学药学院2, http://www.100md.com(高坤 于艳萍 王晓英)
【关键词】注射用去甲斑蝥酸钠；含量测定；有关物质
【中图分类号】R485 【文献标识码】B 【文章编号】1005-0515(2011)06-0413-02
去甲斑蝥酸钠是一种抗肿瘤药物，由去甲斑蝥素与氢氧化钠反应制得。去甲斑蝥酸钠临床用于肝癌、食管癌、肺癌等的书签用药或联合用药，能够干扰癌细胞的分裂，抑制癌细胞DNA合成，但对正常骨髓细胞不抑制，并能升高白细胞[1]。在去甲斑蝥酸钠注射液的国家标准中[2]，采用在外分光光度法进行含量测定，以去甲斑蝥素为对照品。注射用去甲斑蝥素尚无国家标准，本文则采用RP-HPLC法对注射用去甲斑蝥酸钠的含量及有关物质进行了测定。
1 仪器与试药
日立L2000高效液相色谱仪；注射用去甲斑蝥酸钠(自制，规格：10mg/支)；去甲斑蝥素对照品；磷酸二氢铵(分析纯，天津市博迪化工有限公司)；乙腈(天津康科德化工有限公司)；磷酸(分析纯，天津市博迪化工有限公司)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件:通过酸、碱、氧化、热、光破坏试验，确定一下色谱条件，在该条件下，所有降解产物色谱峰与主成分色谱峰分离度良好。
色谱柱：ODS-C18柱(4.6× 200mm，5μm)；流动相为乙腈-0.01mol•L-1磷酸二氢铵溶液(8:92，磷酸调节pH3.1)，检测波长：211nm；流速：1.0mL•min-1；柱温为35℃，进样量为20μL。
2.2 专属性考察:①取流动相20 μL注入液相色谱仪，结果表明流动相不干扰有关物质的检查。②取辅料适量，加流动相适量使溶解，摇匀，滤过；取滤液20 μL注入液相色谱仪，结果表明辅料无干扰。
2.3 定量限:取去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL-1的对照品溶液1mL，加水稀释至100mL，进样20μL测定，确定定量限为2.1μg。
2.4 标准曲线的绘制：对照品溶液：取去甲斑蝥素对照品约50mg,精密称定，置10mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液适量置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，配制成含去甲斑蝥素对照品0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg•mL 的溶液，分别精密量取20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程A=474766C，r=0.9997。去甲斑蝥素质量浓度在0.25～4.0mg•mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验:为考察方法的精密度，取同一份去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL 的对照品溶液20μL，重复进样6次，测得峰面积的RSD为0.18%。
2.6 稳定性试验：取去甲斑蝥素浓度为1.0 mg•mL 的对照品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，10h取20μL进样，测得峰面积的RSD为0.71%，说明溶液室温放置在10h内稳定。
2.7 回收率试验：按处方量的80%，100%和120%进行回收率试验。分别取去甲斑蝥素对照品适量(约80，100，120mg)，精密称定，然后按处方比例加入辅料，加流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果表明低、中、高三种浓度的回收率(n=3)分别为100.3%，99.4%和99.2%，平均回收率(n=9)为99.63%，RSD为0.62%。说明选取的高效液相色谱法准确度良好。
2.8 含量测定：取自制样品，倾出内容物，精密称定(约相当于去甲斑蝥素10mg)，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另取对照品约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别去上述溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果表明三批样品的含量分别为101.7%，101.7%，101.8%。
2.9 有关物质测定:
2.9.1 测定方法:取装量差异项下的本品适量，精密称定(相当于去甲斑蝥素20 mg)于10mL量瓶中,加流动相稀释制成每1mL中约含去甲斑蝥素2mg的溶液作为供试品溶液；精密量取2 mL于100mL量瓶，加流动相制成每1mL中含40μg去甲斑蝥素的溶液，作为对照溶液。以高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录V D)测定，精密量取对照溶液20μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液20μL注入液相色谱仪，记录时间为去甲斑蝥素保留时间的3倍。在供试品溶液色谱图中，所有杂质峰面积之和，不得大于对照溶液的主峰面积。测得三批样品的有关物质量为0.92%，0.84%，0.93%。
3 讨论
由于目前仍无注射用去甲斑蝥酸钠的国家标准，根据去甲斑蝥酸钠注射液的相关标准，采用乙腈-0.01mol•L 磷酸二氢铵溶液(8:92，磷酸调节pH3.1)为流动相，系统色谱峰对称性良好，保留时间在7.1min左右，能使主峰与酸、碱、氧化、高温破坏产生的降解产物分离。潘正[3]等人曾报道C18柱对去甲斑蝥酸钠的保留能力较差，可能是由于他们测定的是去甲斑蝥酸钠冻干粉针，该制剂的辅料对C18柱的保留能力产生了一定的影响。陈杰[4]等曾经用HPLC法测定注射用去甲斑蝥酸钠含量与有关物质，流动相为0.02 mol•L磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-甲醇(75:25)，采用DAD检测。本法pH与其接近，但用乙腈代替甲醇，降低了有机相用量；采用紫外分光光度法，使主峰与破坏后的降解产物峰和杂质峰都得到了良好的分离。本法对三批样品进行了检验，结果有关物质均不大于1.0%。本法方便、准确，可以用作注射用去甲斑蝥酸钠的质量控制方法。
参考文献
[1] 李柏, 凌昌全. 去甲斑蝥素基础及临床研究进展[ J ]. 中草药, 2002, 33(2) : 184-185
[2] 国家药典委员会.国家药品标准(三册)[S]. 北京：人民卫生出版社，2002: 62
[3] 潘正, 付侃, 付晓泰. RP-HPLC法测定去甲斑蝥酸钠冻干粉针的含量[J]. 中国药物应用与检测, 2009, 6 (4): 215-217
[4] 陈杰, 李展. HPLC法测定注射用去甲斑蝥酸钠含量及有关物质[J]. 中国药品标准, 2007,8(2):56-58
作者单位：110024 沈阳兴齐制药有限公司1
110016 沈阳药科大学药学院2, http://www.100md.com(高坤 于艳萍 王晓英)