HAC70-多肽复合物疫苗对实验性肿瘤细胞抗肿瘤活性的研究(2)
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参见附件(2244KB，3页)。
1.4.3.3 观察指标：观察并记录两组小鼠皮下肿瘤结节重量、直径、生存时间和腹水出现时间。
1.4.4 3H-TdR掺入释放法检测杀伤活性。
1.4.4.1 制备效应细胞：取末次免疫注射后第5天的实验鼠各1只，拉颈处死，无菌条件下分别取出脾脏，制成单细胞悬液，以RPMI 1640完全培养基(含rIL-2 100IU/ml、15%NCS)调细胞浓度至1.0×107/ml作为效应细胞。
1.4.4.2 靶细胞标记：从新鲜腹水中收集艾氏腹水瘤细胞作为靶细胞(细胞浓度2.0×106/ml)，加入370Kq 3H-TdR(约10μCi)，于37℃水浴中孵育3h(每30min震荡1次)，彻底洗涤后用RPMI 1640调细胞浓度至2.0×105/ml。
1.4.4.3 细胞培养和活性测定：将100μl效应细胞、50μl已标记的靶细胞加入96孔培养板中(每组3～4个复孔)，使效靶比分别为200∶1、100∶1、50∶1和25∶1。20×g-30s离心，每孔加入混合酶液(1.2%胰蛋白酶、100μgDNA酶)50μl，于37℃水浴中消化30min，收集细胞于玻璃纤维滤膜，洗涤、干燥后放于闪烁杯中(含5ml闪烁液)在液闪计数器上测定脉冲数/min(CPM)，并计算出特异释放率。计算公式：
释放率(%)=(1-实验组CPM/对照组CPM)×100%
1.5 实验数据处理：以均数±标准差(x±s)表示，成对数据采用方差分析(χ2)。
2 结果
2.1 不同热休克条件下对艾氏腹水瘤细胞增殖的影响：见表1。
由表1可见，在42℃和43℃热休克时肿瘤细胞在10h内的生存率>95%，并保持一定水平的增殖，而在44℃-2h后生存细胞数即迅速下降。
2.2 肿瘤疫苗的保护作用：以纯化的HAC70免疫过的小鼠抗肿瘤情况如表2所示。
由表2可见，免疫组小鼠皮下肿瘤结节平均重(1.26±0.37)g，较对照组有明显减轻(P<0.05)；肿瘤直径(1.09±0.36)cm，比对照组有明显减小(P<0.05)；腹水出现时间为(10.70±3.32)d，较对照组有明显延迟(P<0.05)；生存时间为(25.90±9.60)d，较对照组有明显延长(P<0.05)。
2.3 HAC70对小鼠脾细胞杀伤活性的影响：以3H-TdR释放法测定小鼠脾细胞杀伤活性结果如表3。
由表3可知，在效靶比为100∶1时免疫组效应细胞的杀伤活性是(39.25±3.50)%，明显高于对照组(18.50±9.95)%及荷瘤组(25.75±8.38)%，差异有显著性意义(P<0.05)；在效靶比为200∶1时，免疫组效应细胞的杀伤活性是(49.25±11.25)%，明显高于对照组(20.00±7.26)%和荷瘤组(26.75±7.93)%，差异有显著性意义(P<0.01)。
3 讨论
3.1 关于热休克条件的选择：在研究热休克疫苗诱发抗肿瘤效应时常选用42℃-0.5～1h为热休克条件，而本组研究表明，42℃和43℃-10h为艾氏腹水瘤细胞最佳、非致死性热休克条件，在超过了上述两个温度的情况下，瘤细胞在10h内的生存率急剧下降，且残存的细胞体积也明显小于生长正常的肿瘤细胞。为稳定实验条件，在实验中采用42℃-10h作为本实验的热休克条件。
3.2 HAC70的抗肿瘤增殖作用：本研究首先观察到免疫组小鼠接种的肿瘤重量、肿瘤结节直径较荷瘤小鼠有明显减小；腹水出现时间、生存期较对照组和荷瘤小鼠有明显延长，表明经纯化的HAC70具有诱导机体提高对肿瘤的免疫杀伤作用或者又进一步打破肿瘤细胞对机体的免疫耐受，从而提高荷瘤机体的抗肿瘤能力。这与Srivastava PK等[2]的报告相近，即热休克蛋白-多肽复合物起到了肿瘤疫苗的作用。
在对于HAC70诱导的体外杀伤肿瘤细胞实验中，选用新鲜的而不是培养传代的脾细胞作为效应细胞，是为了保持CD4+的T淋巴细胞的辅助作用，使实验更接近于在体的效果。研究中发现免疫组、荷瘤组及对照组小鼠脾细胞对艾氏腹水瘤细胞的杀伤活性均依效靶比(E：T)的增高而增强，但在25∶1、50∶1这两个效靶比的结果都没有统计学意义，这可能与效应细胞浓度过低或者在脾细胞的总量中去掉一部分B淋巴细胞后，所含的T杀伤细胞数量进一步有所降低所致。当效靶比≥100∶1时，免疫组小鼠脾细胞的杀伤活性显著高于荷瘤组和对照组，表明纯化的HAC70能有效地激发荷瘤宿主的这种特异性免疫机制，虽然荷瘤组小鼠脾细胞的杀伤活性较对照组也有所提高，但总效能仍不如免疫组，这是因为荷瘤组的机体免疫功能在给予HAC70疫苗前已有明显的下降，而HAC70的免疫激发作用也可能需要更长、更复杂的过程[3]，这也与临床实际相符。
3.3 热休克蛋白作为肿瘤疫苗作用机制的探讨：作为肿瘤疫苗最重要的作用是该物质能作为肿瘤抗原刺激荷瘤机体产生抗肿瘤免疫应答[4，5]，这往往被泛泛地称为提高机体的免疫功能。由于HAC70是由接种该种肿瘤细胞在进行有效的热休克处理后制备出来的，其分子上携带有该肿瘤的抗原肽，因此HAC70对于实验小鼠的免疫刺激而产生的免疫应答是特异的，是专门针对本次接种的艾氏腹水瘤的。又由于所提取的HAC70分子中的肽为单肽性，任何类型细胞中所有的肽都可以和它进行结合而不受细胞单倍型和主要组织相容复合物(MHC)的影响，且这些肽似乎能反映一个肿瘤细胞的全部免疫信息。尤其是当抗原或T细胞表位还不明确时，这将使HSPs成为一个诱导免疫反应的理想物质。HSPs的另一个重要功能是能将抗原提呈至细胞表面，从而活化T淋巴细胞(CD4+、CD8+T细胞)，特别是诱导细胞毒性杀伤细胞，产生特异性细胞免疫，这里HSPs起到的是载体或佐剂的作用，与其连接的肽则为该肿瘤的抗原。在非特异性免疫方面，HSPs还具有活化巨噬细胞、树突状细胞，增强共刺激因子和MHC的表达；活化自然杀伤细胞(NK)及受体为γ/δ的T细胞，引起非MHC限制性免疫活化，从而促进多种细胞因子(如IL-2、TNF、IL-12、IFN等)的释放，这是HSP70与表达于巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞表面受体CD91结合而产生的。这些就使HSPs调动机体整个免疫系统(特异性与非特异性免疫)的免疫活性更为有力，达到全面增强机体免疫功能，以对抗肿瘤的无限制性增殖。据此可能进一步进行其抗肿瘤的临床研究。
【参考文献】
[1] 方伯言 ......
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