Hedgehog信号通路与慢性肝损伤后肝再生的调控(2)
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1.5 反转录聚合酶链反应
反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时间点原代细胞提取物中多种分子标志的表达。引物序列见表1、表2。测定使用ABI RT-PCR反应系统(ABI7000，美国)，操作按设备标准操作程序及相关试剂盒的说明进行。Trizol提取总RNA，3 ?g的总RNA加入到20 ?L反转录反应体系中反转录生成cDNA，然后取5 ?L的cDNA加入到20 ?L的PCR反应体系中进行扩增。反应条件：93 ℃、5 min；94 ℃、30 s，54 ℃、45 s，72 ℃、60 s，35个循环；72 ℃、10 min。反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳。剩余的cDNA置于-20 ℃保留备用。
1.6 实时荧光定量聚合酶链反应
采用半定量荧光探针法实时荧光定量PCR分析不同时间点IHH、PTCH、Gli1、Gli3的表达。实时荧光定量PCR引物与荧光探针序列见表3。实验采用PE 7000全自动荧光定量PCR仪(美国Perkin Elmer公司)并按照标准操作程序进行测定。反转录合成cDNA的步骤同RT-PCR，定量分析以5 mL cDNA及引物和探针加入PCR预混合反应液中进行反应，反应条件为：93 ℃、3 min；93 ℃、45 s，55 ℃、1 min，共40循环。反应结束后，电脑自动分析计算结果。以GAPDH为内参，每个样本重复测量3次，结果以2-△△CT值表示基因表达的相对值，最终结果以3个样本测定结果的平均值作为相应时间点的测定值。
1.7 信号分子IHH和通路激活标志PTCH、Gli1的表达测定
常规免疫组化及Western-blot检测肝组织切片信号分子IHH和通路激活标志PTCH、Gli1的表达，方法参照文献[6 ......
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