参龙汤对脑缺血大鼠学习记忆能力及海马Bcl—2和Bax表达的影响(1)
摘要：目的 观察参龙汤对脑缺血大鼠学习记忆能力及大脑海马区Bcl-2 和 Bax 表达的影响。方法 利用双侧颈总动脉结扎的方法制备慢性脑缺血大鼠模型，50只大鼠随机分为对照组、模型组、脑复康组及参龙汤大、小剂量组。造模后药物处理4周，采用Morris 水迷宫实验观察大鼠逃避潜伏期的时间及跨越平台的次数，采用免疫组化方法观察大鼠海马Bcl-2 和 Bax 表达的变化。结果 模型组大鼠逃避潜伏期时间较对照组明显延长，跨越平台次数较对照组明显减少(P<0.01)。参龙汤大剂量组大鼠的逃避潜伏期时间较模型组明显缩短(P<0.05)，跨越平台次数明显增加(P<0.05)；参龙汤大剂量组大鼠海马Bax蛋白阳性表达显著低于模型组(P<0.05)，Bcl-2蛋白阳性表达则显著高于模型组(P<0.01)。结论 参龙汤可以改善脑缺血大鼠学习记忆能力，其作用机理可能与增加脑缺血大鼠海马Bcl-2蛋白阳性表达、减少Bax蛋白阳性表达有关。
关键词：参龙汤；脑缺血；学习记忆能力；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)10-0041-03
随着我国人口老龄化趋势日益严重，缺血性脑血管病的发生率不断升高，有关缺血性脑血管病所引起的学习、记忆的保护作用及其神经生物学机制的研究一直是神经科学的研究热点。目前研究认为：缺血性神经元损伤的病理较为复杂，主要过程包括神经细胞的自身损伤机制和脑缺血性损伤级联反应，其中神经细胞的凋亡发挥着重要的作用[1]。细胞凋亡是生命进化过程中为更好地适应生存环境而主动进行的一种死亡过程。研究显示，许多神经系统疾病的发生与细胞异常凋亡有关，如Alzheimer病、痴呆、神经退行性病变、自身免疫性疾病等[2]。凋亡调控蛋白Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抗凋亡蛋白，在中枢神经系统中有表达[3]。近年来，中医药治疗干预脑血管病的研究日益增多，研究发现参龙汤具补肾益气活血的作用，能提高脑缺血大鼠的学习记忆能力[4]。本研究采用慢性脑缺血动物模型，观察参龙汤对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力，以及对海马凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的影响，为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，鼠龄3个月，体质量180～220 g，雌雄各半，中国人民解放军总医院医学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(京)2009-0015。
1.2 药物、试剂与仪器
参龙汤(由中国人民解放军总医院中医科提供处方，制剂室制备)，吡拉西坦(脑复康，石家庄中诺药业有限公司，批号09075103)。Bcl-2多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号990785W)，Bax多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号909901W)；二抗显色试剂盒：EnVision Detection Kit 基因科技(上海)有限公司产品(Code No.GK500705)。全自动真空脱水机(LEICAASP300)、组织包埋机(LEICA EG1140H)、石蜡切片机(LEICA RM2135)、展片机(LEICA HI1210)：德国LEICA公司；光学显微镜：日本OLYMPUS BX60系统显微镜。
1.3 造模与分组
根据文献[5]制备慢性脑缺血模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛腹腔麻醉(30 mg/100 g)后，备皮消毒，剪开颈部皮肤，找到双侧颈总动脉，0号丝线结扎。伤口撒头孢唑啉钠粉末(0.25 g/只)后逐层缝合，放回笼中饲养。对照组10只大鼠仅分离颈总动脉，不做任何处理。造模后大鼠分为模型组、脑复康组及参龙汤小、大剂量组，每组10只，排除有明显肢体障碍的大鼠，最后模型组8只、参龙汤大剂量组8只、参龙汤小剂量组9只、脑复康组8只纳入统计。术后3 d开始参照文献[6]方法给药，根据参龙汤和脑复康的临床口服用量，按体质量换算出大鼠对应于人的等效量定为小剂量组及脑复康组的剂量，确定参龙汤小、大剂量组和脑复康组分别含原药材80、240、90 g/L。治疗组大鼠每只灌胃1 mL/d，对照组、模型组大鼠等量生理盐水灌胃，连续4周。
1.4 Morris水迷宫实验
给药4周后进行水迷宫实验，在暗室中放置一直径1.3 m、深0.5 m圆形水池，池壁为黑色，标明A、B、C、D四个象限，在任一象限放置一个直径10 cm、高30 cm的安全平台，水面没过平台约2 cm，水中注入适量墨汁，以目视看不到平台为宜，水温控制在26 ℃左右；大鼠训练2 d，开始实验5 d，记录大鼠寻找到安全平台的时间(即逃避潜伏期)作为学习成绩；第6日撤去平台，选第二象限入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录90 s内大鼠跨越原平台次数，作为大鼠记忆成绩。
1.5 免疫组化
水迷宫实验结束后大鼠10%水合氯醛(3 mL/kg )腹腔注射麻醉，暴露心脏，断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱[7]对大鼠海马组织取材、脱水、包埋，置于APES防脱玻片上。60 ℃烤片4 h，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)浸洗2 min，共3次；3%H2O2 10 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)。微波热修复后，滴加一抗Bcl-2(1∶150)、Bax(1∶300)，阴性对照组加0.01 mol/L PBS代替一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，常规脱水，透明，中性树胶封片。图像分析采用Image Pro plus 5.1 图像分析系统测定每张照片的平均光密度值，每张切片同一部位取5个不同的视野。, http://www.100md.com(陈利平等)
关键词：参龙汤；脑缺血；学习记忆能力；Bcl-2蛋白；Bax蛋白；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)10-0041-03
随着我国人口老龄化趋势日益严重，缺血性脑血管病的发生率不断升高，有关缺血性脑血管病所引起的学习、记忆的保护作用及其神经生物学机制的研究一直是神经科学的研究热点。目前研究认为：缺血性神经元损伤的病理较为复杂，主要过程包括神经细胞的自身损伤机制和脑缺血性损伤级联反应，其中神经细胞的凋亡发挥着重要的作用[1]。细胞凋亡是生命进化过程中为更好地适应生存环境而主动进行的一种死亡过程。研究显示，许多神经系统疾病的发生与细胞异常凋亡有关，如Alzheimer病、痴呆、神经退行性病变、自身免疫性疾病等[2]。凋亡调控蛋白Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抗凋亡蛋白，在中枢神经系统中有表达[3]。近年来，中医药治疗干预脑血管病的研究日益增多，研究发现参龙汤具补肾益气活血的作用，能提高脑缺血大鼠的学习记忆能力[4]。本研究采用慢性脑缺血动物模型，观察参龙汤对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力，以及对海马凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax表达的影响，为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级Wistar大鼠，鼠龄3个月，体质量180～220 g，雌雄各半，中国人民解放军总医院医学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(京)2009-0015。
1.2 药物、试剂与仪器
参龙汤(由中国人民解放军总医院中医科提供处方，制剂室制备)，吡拉西坦(脑复康，石家庄中诺药业有限公司，批号09075103)。Bcl-2多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号990785W)，Bax多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号909901W)；二抗显色试剂盒：EnVision Detection Kit 基因科技(上海)有限公司产品(Code No.GK500705)。全自动真空脱水机(LEICAASP300)、组织包埋机(LEICA EG1140H)、石蜡切片机(LEICA RM2135)、展片机(LEICA HI1210)：德国LEICA公司；光学显微镜：日本OLYMPUS BX60系统显微镜。
1.3 造模与分组
根据文献[5]制备慢性脑缺血模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛腹腔麻醉(30 mg/100 g)后，备皮消毒，剪开颈部皮肤，找到双侧颈总动脉，0号丝线结扎。伤口撒头孢唑啉钠粉末(0.25 g/只)后逐层缝合，放回笼中饲养。对照组10只大鼠仅分离颈总动脉，不做任何处理。造模后大鼠分为模型组、脑复康组及参龙汤小、大剂量组，每组10只，排除有明显肢体障碍的大鼠，最后模型组8只、参龙汤大剂量组8只、参龙汤小剂量组9只、脑复康组8只纳入统计。术后3 d开始参照文献[6]方法给药，根据参龙汤和脑复康的临床口服用量，按体质量换算出大鼠对应于人的等效量定为小剂量组及脑复康组的剂量，确定参龙汤小、大剂量组和脑复康组分别含原药材80、240、90 g/L。治疗组大鼠每只灌胃1 mL/d，对照组、模型组大鼠等量生理盐水灌胃，连续4周。
1.4 Morris水迷宫实验
给药4周后进行水迷宫实验，在暗室中放置一直径1.3 m、深0.5 m圆形水池，池壁为黑色，标明A、B、C、D四个象限，在任一象限放置一个直径10 cm、高30 cm的安全平台，水面没过平台约2 cm，水中注入适量墨汁，以目视看不到平台为宜，水温控制在26 ℃左右；大鼠训练2 d，开始实验5 d，记录大鼠寻找到安全平台的时间(即逃避潜伏期)作为学习成绩；第6日撤去平台，选第二象限入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录90 s内大鼠跨越原平台次数，作为大鼠记忆成绩。
1.5 免疫组化
水迷宫实验结束后大鼠10%水合氯醛(3 mL/kg )腹腔注射麻醉，暴露心脏，断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱[7]对大鼠海马组织取材、脱水、包埋，置于APES防脱玻片上。60 ℃烤片4 h，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)浸洗2 min，共3次；3%H2O2 10 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)。微波热修复后，滴加一抗Bcl-2(1∶150)、Bax(1∶300)，阴性对照组加0.01 mol/L PBS代替一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB显色光镜下控制时间，常规脱水，透明，中性树胶封片。图像分析采用Image Pro plus 5.1 图像分析系统测定每张照片的平均光密度值，每张切片同一部位取5个不同的视野。, http://www.100md.com(陈利平等)