糖耐康对转化生长因子—β1诱导人肾小管上皮细胞Smad 2、3、7 mRNA表达的影响(2)
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参见附件。
2.3 分组
细胞以6000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔200 ?L，每组设3个复孔，培养过夜。吸弃细胞上清，加入无血清培养基同步化24 h。再次弃细胞上清，按照分组加入相应药品的培养液200 ?L，继续培养24 h。提取RNA进行PCR实验操作。
总RNA抽提：①用枪头吸尽培养基，向各孔加入125 ?L×2的Washing Buffer。②用枪头吸尽Cell AmpTM Washing Buffer，后向各孔中加50 ?L的Processing溶液，反复吹打Processing液后，移至微量离心管中。③75 ℃水浴5 min，分装得到的细胞裂解液。将提取出的总RNA进行完整性分析及纯度测定。
反转录反应：根据RT反应体系(见表1)，于PCR管中相应体积的5×PrimeScriptTM Buffer，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ，Oligo dT primer(50 ?mol/L×1，Random 6 mers，RNase Free dH2O分装，再加入RNA样品，迷你离心机混匀，进行PCR反转录反应：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反转录所得产物为模板cDNA，-20 ℃保存以备后续扩增用。此过程均在冰上操作。
PCR扩增反应：根据PCR反应体系(见表2)，于PCR管中加入相应体积的SYBR Premix Ex TapⅡ(2×)，PCR Forward Primer(10 ?mol/L)，PCR Reverse Primer(10 ?mol/L)，dH20和cDNA模板，迷你离心机混匀；两步法PCR扩增程序：预变性95 ℃ 31 s；PCR反应：95 ℃ 5 s，64 ℃ 40 s ......
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