糖网明目颗粒提取物对缺氧/高糖状态下血管内皮细胞肿瘤坏死因子—α、白细胞介素—1α表达的影响(3)
琼脂糖凝胶电泳及图像分析：1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Lane ID凝胶图像分析软件对PCR产物进行半定量分析测定，基因表达水平以β-actin为参比。
2.3 ELISA检测缺氧/高糖细胞相关蛋白表达
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，吸取细胞上清液至预冷的1.5 mL无菌EP管中，同组混匀，封口，-80 ℃保存备用。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用PBS调整总蛋白至相同浓度。标准品按照说明书稀释5个梯度，各梯度每孔加样均为50 μL。分别设空白孔、待测样品孔，每组3个复孔。向待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，混匀。封板膜封板后于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，重复洗5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL。封板膜封板后37 ℃温育30 min，如前法重复洗5次，拍干。每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。450 nm波长处依序测各孔光密度(OD值)。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品OD值代入方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析 ......
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2.3 ELISA检测缺氧/高糖细胞相关蛋白表达
细胞分组及药物干预同“2.1”项。药物干预24 h后，吸取细胞上清液至预冷的1.5 mL无菌EP管中，同组混匀，封口，-80 ℃保存备用。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，用PBS调整总蛋白至相同浓度。标准品按照说明书稀释5个梯度，各梯度每孔加样均为50 μL。分别设空白孔、待测样品孔，每组3个复孔。向待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，混匀。封板膜封板后于37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃液体，甩干，每孔加满洗涤液，重复洗5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL。封板膜封板后37 ℃温育30 min，如前法重复洗5次，拍干。每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。450 nm波长处依序测各孔光密度(OD值)。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品OD值代入方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
3 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析 ......
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