论著辛伐他汀联合PMA对SHI-1细胞增殖与凋亡的影响(2)
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1.2方法
1.2.1MTT法检验药物对SHI-1细胞抑制作用将对数生长期的SHI-1细胞接种于96孔板中，浓度为2×105/ml，然后加入不同浓度的SV和PMA，每孔100μL，分组如上所述，每组有3个复孔。空白对照孔加RPMI 1640培养液100μL。培养24，48，72 h后，分别加入5mg/mL MTT液15μL，再37℃孵育4 h后加入0.04 mmol/L酸化异丙醇100μL溶解结晶，于490nm波长处用用酶标仪检测吸光度(A)值。计算细胞生长抑制率。生长抑制率%= [1-(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)]%。
1.2.2检测细胞分化及凋亡取1000000个细胞，预冷的PBS洗两次(2000r/5min)，然后加入 10μL的AnnexinV 缓冲液用于悬浮细胞后再分别加入5μLAnnexinⅤ-FITC，5μLPI-PE，混匀，于遮光处放置15min，再加AnnexinV 缓冲液500μL，2000r/min，离心5 min。用FACSCalibur流式细胞仪检测SHI-1细胞的分化与凋亡。
1.2.3检测WT1和hDMP1药物处理后细胞中表达的变化各组细胞培养后24，48 ，72h后收集1×106个SHI-1细胞。按RNA提取试说明书操作提取总RNA，在紫外分光光度仪中定量；RNA反转录合成cDNA， 逆转录体系20μL，其中总RNA 2μg。GAPDH、hDMP1PCR反应体系为：总体积为25μl，cDNA2μL，10×buffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl2 2 .5μL,10mmol/L dNTP 0.5μL， 5u/μLTaq酶0.25μL，100μmol/L引物探针各0.1μL，加双蒸水补足反应总体积为25 L 。反应条件为： 95℃ 5 min热启动，然后95℃ 10 s变性。58℃ 15 s退火延伸，40个循环，58℃延伸时采集荧光信号。WT1的反应体系为：总体积为25μl ......
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