同型半胱氨酸对巨噬细胞中Line-1 DNA甲基化标准曲线的影响
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摘要：目的寻找简单、可靠、经济准确的检测巨噬细胞中Line-1 甲基化水平的实验方法。方法体外培养单核细胞源性巨噬细胞，不同浓度Hcy作用后以甲基化特异性PCR检测Line-1 DNA甲基化水平变化后，分别克隆扩增相应的片段，将不同浓度稀释的甲基化和非甲基化样品分别加入到荧光PCR体系中，按照荧光PCR体系进行操作，检测其荧光表达，根据相应的稀释倍数与扩增数做出相应的标准曲线。结果各Hcy浓度组的Line-1 DNA甲基化程度随Hcy浓度的增高甲基化程度升高，Line-1 DNA甲基化程度与对照组比较，分别上升了1.30、1.52、1.61、2.18倍，差异有统计学意义(P<0.05)；分别得到Line-1 DNA甲基化标准曲线：Y=-4.3448x+51.512；非甲基化标准曲线：Y=-2.7406x+36.208。结论Line-1 DNA甲基化与Hcy介导的动脉粥样硬化关系密切，荧光定量PCR法建立的标准曲线是检测Line-1 DNA甲基化水平的一种方便且准确的方法。
关键词：LINE-1；巨噬细胞；同型半胱氨酸；DNA甲基化；荧光定量PCR
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病重要的基础性病变，在AS形成过程中，单核细胞在相关危险因子的作用下转化为巨噬细胞，巨噬细胞细胞的形成是AS主要病理特征之一。同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是AS的独立危险因子[1]，同时有报道指出Hcy可以改变巨噬细胞中保守序列Line-1 DNA甲基化水平从而影响其表达，并由此进一步导致了AS的发生。目前检测甲基化水平的方法很多，但大多属于定性或半定量方法，且在Hcy介导巨噬细胞致AS中Line-1 DNA甲基化水平变化目前人们关注较少，检测方法单一、不准确。本文旨在通过观察Hcy对THP-1单核细胞源性巨噬细胞形成中Line-1 DNA甲基化水平的改变，建立一种新型、高效方便且准确可行的检测DNA甲基化的新方法。
1资料与方法
1.1一般资料干粉末RPMI-1640培养基(GIBCO.BKI公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)；Hcy、L-多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)、谷氨酰胺、佛波酯(PMA)(Sigma公司)；THP-1单核细胞株(四川大学华西医学院)、DNA甲基化检测试剂盒(赛默公司)、DNA提取试剂盒(promage 公司)。
1.2仪器相差显微镜(日本Nikon公司产品)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；全自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安YXQ-LS50A)；微量台式离心机(Eppendorf)；CO2孵箱(Heraeus, Germany)；Model680全自动酶标仪(Bio-rad ......
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