分子技术在流感病毒诊断中的应用
摘要：本文主要从定性PCR扩增，实时荧光定量RT-PCR，测序法，基因芯片技术这4个方面分析了分子技术在流感病毒诊断中的应用，从而为分子生物学的应用提供了方向。
关键词：分子技术；流感病毒诊断；定性PCR；RT-PCR；测序法；基因芯片技术
流行性感冒病毒(influenza virus)属于是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。分子技术应用于流感病毒的诊断对分子生物学以及医学研究和社会发展具有重要意义。
1 定性PCR扩增：逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
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逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的科学原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。将逆转录-聚合酶链反应用来鉴别当前的流感病毒的型别，使用的扩增片段一般应该具有高度保守序列的核蛋白以及M蛋白；如果用逆转录-聚合酶链反应来鉴定一种流感病毒的亚型，那么就应该针对编码表面的抗原基因具有的保守序列去设计引物。
根据目前相关生物研究所对HA的研究，各中流感亚型病毒HA蛋白裂解位点的氨基酸是不同的，HA即是血凝素，红血球凝聚素。在流感的病毒的表面存在两种蛋白质，一种称为红血球凝聚素(hemagglutinin)，另一种为神经氨酸酶(neuraminidase)。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“N”指代后者。而就目前而言，红血球凝聚素有16(H1～H16)种形态，神经氨酸酶则有9(N1～N9)种形态。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。
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2 实时荧光定量RT-PCR
实时PCR(real time-PCR)。实时PCR也就是指利用荧光信号累积进行实时监测整个PCR的进程，然后以标准曲线或者公式法来定性和定量对流感病毒中的RNA模板进行分析。对实时技术来说，它指的是在同管内去进行扩增以及检测，这也是是分生物分子技术诊断方法进步的标志，对于这种定量所使用荧光色素来说，目前研究以及医学临床的所用的荧光探针还是较多的，主要是由以下的多种构成：荧光共振能量转移(FRET)杂交双探针、YBR gr een荧光染料法以及Taqman水解探针(cleavage-based pr obes)等等，其中Taqman水解探针一般是用于检测H1N1流感病毒，它的敏感性高达110 copy/mL。
荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术是基于PCR技术基础之上的。这种技术具有能够对DNA的高效扩增、以及探针技术的高特异性，光谱技术的高度敏感性以及定量等等的优点，实时荧光定量RT-PCR主要拥有以下的优势：快速，以及能够对反应体系的PCR产物进行实时的监控，也就是当PCR结束之时即获得了检测的结果，整个过程只需要维持2h；经济，这种技术在病毒检测中应用能够节省电泳以及染色，避免反应体系的产物被污染；灵敏度高，由于实时荧光定量RT-PCR采用了特异性的荧光探针以及高灵敏度的CCD技术，使检测相比传统的PCR方法在灵敏度方面高达100～1 000倍并提高了检测的准确性。
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3 测序法
在逆转录-聚合酶链反应过程中，当RT-PCR和实时RT-PCR不能获得流感病毒的基因序列信息以及在反应过程中检测出流感病毒的型别却不能分型的时候，可以采取对RT-PCR的反应体系的产物进行测序，和对流感病毒进行鉴定以及流感病毒的亚型判断还有它的致病性分析。这也就是说当没有具体的流感病毒的检测方法，我们可以将测序作为对病毒检测的临时检测方法。测序法的另外一个好处就是，如果有新流感亚型病毒出现的时候，这种测序的检测方法不仅能够检测出这种新的病毒亚型，而且还能够作为其他检测方法的验证实验。
4 基因芯片
基因芯片，它的技术原理和经典核基因芯片到底技术原理是一样的，具体到流感病毒的检测中也就是针对流感病毒的基因组序列的保守区域，进行特异性检测探针的设计，同时制备流感病毒的检测芯片，进而对流感病毒的病毒靶序列使用限制性的显示技术进行标记，最后将这种标记的产物与基因芯片进行杂交清洗以及扫描，之后对结果进行科学的分析。总的来说，这种方法对流感病毒以及其亚型的早期检测是极其有效的，具有高敏感性以及高通量和高灵敏度，检测的准确性也极高。
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总而言之，由于时代的不断向前的发展以及生物科学技术的提高，生物分子技术应用于医院临床研究也开始成为的生物分子科学发展的必然趋势。就前文所述的生物分子技术，多重荧光RT-PCR，由于它本身具有快速、灵敏以及特异的优点，能够迅速快捷准确的得出检测的结果，可以将它应用于流感病毒的快速诊断中，不仅如此，由于流感病毒的变异性极强，因此应用生物分子技术对它检测而具有其他检测技术没有的优势-能够迅速的判断出病毒的种类。随着生物分子技术的不断进步，这使得流感病毒的快速确证性诊断已经成为可能发生的事实，有其是在流感大暴发时期，这种技术的应用能够快速的控制流感病毒的蔓延，生物分子，所以，对分子技术在流感病毒诊断中的应用分析是有其必要性的，这对医学以及生物分子学还有社会的稳定和谐来说，都具有积极的意义[1-5]。
参考文献：
[1]Yea C，Adachi D，Johnson G，et al.Design of a single tube RT-PCR assay for the diagnosis of human infection with highly pathogenic influenza A(H 5)viruses[J].J Virol Methods，2007，13(2)：220-226.
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[2]蔡欣，朱泽轶，邹民吉，等.流感病毒诊断方法的研究进展[J].医学研究杂志，2009，38(5)：7-9.
[3汪维鹏，武海萍，周国华.焦测序法检测禽流感[J].分析化学，2008，36(6)：775-780.
[4]姜晓慧，陈寅，卢亦愚，等.甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用[J].中国疫苗和免疫，2008，14(3)：242-245.
[5]黄文林.分子病毒学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2006：431-450.
编辑/苏小梅, http://www.100md.com(吴利军 冯广红)
关键词：分子技术；流感病毒诊断；定性PCR；RT-PCR；测序法；基因芯片技术
流行性感冒病毒(influenza virus)属于是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表种，简称流感病毒。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。乙型流感病毒对人类致病性较低；丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。分子技术应用于流感病毒的诊断对分子生物学以及医学研究和社会发展具有重要意义。
1 定性PCR扩增：逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
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逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的科学原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。将逆转录-聚合酶链反应用来鉴别当前的流感病毒的型别，使用的扩增片段一般应该具有高度保守序列的核蛋白以及M蛋白；如果用逆转录-聚合酶链反应来鉴定一种流感病毒的亚型，那么就应该针对编码表面的抗原基因具有的保守序列去设计引物。
根据目前相关生物研究所对HA的研究，各中流感亚型病毒HA蛋白裂解位点的氨基酸是不同的，HA即是血凝素，红血球凝聚素。在流感的病毒的表面存在两种蛋白质，一种称为红血球凝聚素(hemagglutinin)，另一种为神经氨酸酶(neuraminidase)。高致病性禽流感病毒H5N1中的“H”指代前者，“N”指代后者。而就目前而言，红血球凝聚素有16(H1～H16)种形态，神经氨酸酶则有9(N1～N9)种形态。血凝素蛋白水解后分为轻链和重链两部分，后者可以与宿主细胞膜上的唾液酸受体相结合，前者则可以协助病毒包膜与宿主细胞膜相互融合。血凝素在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要角色。
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2 实时荧光定量RT-PCR
实时PCR(real time-PCR)。实时PCR也就是指利用荧光信号累积进行实时监测整个PCR的进程，然后以标准曲线或者公式法来定性和定量对流感病毒中的RNA模板进行分析。对实时技术来说，它指的是在同管内去进行扩增以及检测，这也是是分生物分子技术诊断方法进步的标志，对于这种定量所使用荧光色素来说，目前研究以及医学临床的所用的荧光探针还是较多的，主要是由以下的多种构成：荧光共振能量转移(FRET)杂交双探针、YBR gr een荧光染料法以及Taqman水解探针(cleavage-based pr obes)等等，其中Taqman水解探针一般是用于检测H1N1流感病毒，它的敏感性高达110 copy/mL。
荧光定量PCR技术。荧光定量PCR技术是基于PCR技术基础之上的。这种技术具有能够对DNA的高效扩增、以及探针技术的高特异性，光谱技术的高度敏感性以及定量等等的优点，实时荧光定量RT-PCR主要拥有以下的优势：快速，以及能够对反应体系的PCR产物进行实时的监控，也就是当PCR结束之时即获得了检测的结果，整个过程只需要维持2h；经济，这种技术在病毒检测中应用能够节省电泳以及染色，避免反应体系的产物被污染；灵敏度高，由于实时荧光定量RT-PCR采用了特异性的荧光探针以及高灵敏度的CCD技术，使检测相比传统的PCR方法在灵敏度方面高达100～1 000倍并提高了检测的准确性。
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3 测序法
在逆转录-聚合酶链反应过程中，当RT-PCR和实时RT-PCR不能获得流感病毒的基因序列信息以及在反应过程中检测出流感病毒的型别却不能分型的时候，可以采取对RT-PCR的反应体系的产物进行测序，和对流感病毒进行鉴定以及流感病毒的亚型判断还有它的致病性分析。这也就是说当没有具体的流感病毒的检测方法，我们可以将测序作为对病毒检测的临时检测方法。测序法的另外一个好处就是，如果有新流感亚型病毒出现的时候，这种测序的检测方法不仅能够检测出这种新的病毒亚型，而且还能够作为其他检测方法的验证实验。
4 基因芯片
基因芯片，它的技术原理和经典核基因芯片到底技术原理是一样的，具体到流感病毒的检测中也就是针对流感病毒的基因组序列的保守区域，进行特异性检测探针的设计，同时制备流感病毒的检测芯片，进而对流感病毒的病毒靶序列使用限制性的显示技术进行标记，最后将这种标记的产物与基因芯片进行杂交清洗以及扫描，之后对结果进行科学的分析。总的来说，这种方法对流感病毒以及其亚型的早期检测是极其有效的，具有高敏感性以及高通量和高灵敏度，检测的准确性也极高。
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总而言之，由于时代的不断向前的发展以及生物科学技术的提高，生物分子技术应用于医院临床研究也开始成为的生物分子科学发展的必然趋势。就前文所述的生物分子技术，多重荧光RT-PCR，由于它本身具有快速、灵敏以及特异的优点，能够迅速快捷准确的得出检测的结果，可以将它应用于流感病毒的快速诊断中，不仅如此，由于流感病毒的变异性极强，因此应用生物分子技术对它检测而具有其他检测技术没有的优势-能够迅速的判断出病毒的种类。随着生物分子技术的不断进步，这使得流感病毒的快速确证性诊断已经成为可能发生的事实，有其是在流感大暴发时期，这种技术的应用能够快速的控制流感病毒的蔓延，生物分子，所以，对分子技术在流感病毒诊断中的应用分析是有其必要性的，这对医学以及生物分子学还有社会的稳定和谐来说，都具有积极的意义[1-5]。
参考文献：
[1]Yea C，Adachi D，Johnson G，et al.Design of a single tube RT-PCR assay for the diagnosis of human infection with highly pathogenic influenza A(H 5)viruses[J].J Virol Methods，2007，13(2)：220-226.
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[2]蔡欣，朱泽轶，邹民吉，等.流感病毒诊断方法的研究进展[J].医学研究杂志，2009，38(5)：7-9.
[3汪维鹏，武海萍，周国华.焦测序法检测禽流感[J].分析化学，2008，36(6)：775-780.
[4]姜晓慧，陈寅，卢亦愚，等.甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用[J].中国疫苗和免疫，2008，14(3)：242-245.
[5]黄文林.分子病毒学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2006：431-450.
编辑/苏小梅, http://www.100md.com(吴利军 冯广红)
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