泥鳅粉对训练小鼠游泳力竭24h后心肌S100A4蛋白表达的影响(2)
1.5检测指标及方法 生物化学法测定血清CK-MB活性，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，操作严格按说明书进行。
心肌组织HE染色：取石蜡切片3～5 μm 于二甲苯中脱蜡30 s，梯度酒精脱水30 s，苏木精-伊红染色1～2 min，再次梯度酒精脱水30 s，二甲苯使切片透明，中性树胶封片于光学显微镜(×200)下观察。
免疫组化检测：石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水和PBS液漂洗，置于枸橼酸盐缓冲液微波炉内加热保持140℃ 5min，室温冷却PBS液冲洗，3%过氧化氢孵育5min，滴加一抗工作液，置于湿盒内4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的二抗，湿盒内37℃孵育20min。PBS液冲洗2 min/3次，DAB显色3～5 min。终止显色后充分水洗，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。DAB阳性产物为浅棕色颗粒。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野，应用北航MIAS医学图像分析系统测定蛋白表达的积分光密度(IOD)。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。光镜为德国LEICA公司产的LEICA DM LB2型双目显微镜，Motic B5 显微摄像系统产自麦克奥迪实业集团公司。
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1.6统计学方法 实验数据以平均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 19统计软件进行分析，样本均数比较组间采用独立样本t检验。P﹤0.05 为具有显著性差异，P﹤0.01 为具有高度显著性差异。
2结果
2.1游泳持续时间和血清CK活性 小鼠游泳至力竭时间(min) T组55.86±20.23，N组为123.52±51.65，N组非常显著地长于T组(P<0.01)，时间延长121.12%。血清CK活性(u.mL-1)，C组为0.89±0.12，T组为1.00±0.37，N组为0.57±0.11。与C组比较，T组偏高(P﹥0.05)，N组显著低于C组与T组(P<0.05)。
2.2心肌细胞HE染色结果 小鼠的心肌细胞胞核呈蓝色，胞质呈红色。C组心肌细胞界限清晰，结构正常；力竭后24 h，T组的心肌细胞界限较模糊，可见少量心肌纤维断裂和间质水肿；N组心肌细胞界限清晰，无心肌纤维断裂，也无明显间质水肿。
, 百拇医药
2.3心肌P53和S100A4蛋白的表达 P53蛋白表达的积分光密度(IOD)C组为461.68±106.23，T组为700.94±60.15，N组为564.48±151.89。T组显著高于C组(P﹤0.05)，N组增高不显著(P﹥0.05)。S100A4蛋白表达的积分光密度，C组为313.29±256.85，T组为452.86±168.79，N组为610.72±283.09。T组呈高于C组趋势(P﹥0.05)，N组却显著高于C组(P﹤0.05)和略高于T组(P﹥0.05)。
3讨论
本实验在负重游泳训练过程中采用生泥鳅干预，小鼠力竭游泳时间延长达121.12%，与既往的研究报导一致[3，5]，无疑有必要实际应用和深入研究生泥鳅对运动机体的作用及机制。
长时间有氧疲劳运动将引发自由基产生脂质过氧化，运动力竭可引起心肌组织中自由基增多，进而造成心肌细胞损伤[6]。一旦组织损伤组织细胞破裂，原本存在于细胞内的物质能在血中被检测到，可用于反映组织损伤，其中血清CK-MB活性的升高与心肌损伤相关[7]。本实验力竭后24 h，单纯训练小鼠可见心肌细胞病理表现、CK-MB活性偏高，力竭运动对小鼠心肌产生了一定损害。血清CK活性随运动时间的延长显著增加[8]，而生泥鳅粉干预小鼠游泳时间延长，24 h后活性却明显降低，心肌细胞无明显病理现象，显然提高了小鼠对超运动负荷的适应，发挥了保护心肌作用，这与已有的保护肝脏研究报导有一致性[3]。其保护作用，势必与小鼠运动耐力提高密切相关。
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细胞受损及其清除的另一种形式是细胞凋亡，p53蛋白是一种抑癌因子，可使内源性Bcl-2表达下调、Bax表达上调，降低Bcl-2/Bax比值，对调节细胞凋亡过程起重要作用[9]。张钧等报道，力竭性运动和过度训练心肌细胞P53表达迅速增高，作为转录因子激活对心肌细胞凋亡调节[10]。心肌细胞P53表达变化在一定程度上可对心肌细胞损伤凋亡情况反映。本实验中单纯训练并力竭运动小鼠心肌细胞P53表达显著增高，可知力竭运动导致心肌损伤的凋亡过程增强。而泥鳅干预使P53增高幅度低，喻示心肌细胞凋亡过程较弱，生泥鳅对超负荷心肌组织确有保护作用。
S100A4是一种钙结合蛋白、促肿瘤转移因子，与肿瘤的发生、发展及预后相关[11]。而其在心血管内皮和心肌表达，有促血管生成，对培养的心肌细胞促进生长和存活作用[12]。有报道，S100A4蛋白表达上调促进损伤心肌细胞生长和存活，抑制细胞凋亡[13]。S100A4与P53蛋白的C末端区域结合，影响其亚细胞定位及转录活性，对细胞凋亡过程调节[14]。大鼠每天跑台力竭训练10d后，心肌和血管内皮细胞空泡变性和心肌间质水肿等，可见血管内皮细胞凋亡特征，同时心肌和血管内皮细胞S100A4蛋白表达显著增高[4]。本研究显示，训练小鼠力竭24 h后心肌P53蛋白表达量增高，S100A4表达增高不明显，反应训练后一次力竭运动的心肌损害轻于反复力竭，但对抗P53降低心肌细胞凋亡损害能力较弱。而生泥鳅降低P53表达、增高S100A4表达，利于降低力竭运动后心肌细胞凋亡。
4结论
负荷游泳训练小鼠力竭24 h后心肌细胞有损害，P53表达上调和S100A4表达较弱，对抗心肌凋亡损害作用有限。生泥鳅干预明显提高运动耐力和降低力竭运动导致的心肌细胞损害，与上调S100A4调节使心肌细胞得到保护作用有关。
参考文献：
[1]钦传光，黄开勋，徐辉碧.泥鳅中的生物活性分子及其药理作用[J].中国生化药物杂志，2002，23(1)：47-48., 百拇医药(刘祥梅 施孟)
心肌组织HE染色：取石蜡切片3～5 μm 于二甲苯中脱蜡30 s，梯度酒精脱水30 s，苏木精-伊红染色1～2 min，再次梯度酒精脱水30 s，二甲苯使切片透明，中性树胶封片于光学显微镜(×200)下观察。
免疫组化检测：石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水和PBS液漂洗，置于枸橼酸盐缓冲液微波炉内加热保持140℃ 5min，室温冷却PBS液冲洗，3%过氧化氢孵育5min，滴加一抗工作液，置于湿盒内4℃冰箱过夜。滴加生物素标记的二抗，湿盒内37℃孵育20min。PBS液冲洗2 min/3次，DAB显色3～5 min。终止显色后充分水洗，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。DAB阳性产物为浅棕色颗粒。在光学显微镜(×400)下每张切片随机观察6个视野，应用北航MIAS医学图像分析系统测定蛋白表达的积分光密度(IOD)。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。光镜为德国LEICA公司产的LEICA DM LB2型双目显微镜，Motic B5 显微摄像系统产自麦克奥迪实业集团公司。
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1.6统计学方法 实验数据以平均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 19统计软件进行分析，样本均数比较组间采用独立样本t检验。P﹤0.05 为具有显著性差异，P﹤0.01 为具有高度显著性差异。
2结果
2.1游泳持续时间和血清CK活性 小鼠游泳至力竭时间(min) T组55.86±20.23，N组为123.52±51.65，N组非常显著地长于T组(P<0.01)，时间延长121.12%。血清CK活性(u.mL-1)，C组为0.89±0.12，T组为1.00±0.37，N组为0.57±0.11。与C组比较，T组偏高(P﹥0.05)，N组显著低于C组与T组(P<0.05)。
2.2心肌细胞HE染色结果 小鼠的心肌细胞胞核呈蓝色，胞质呈红色。C组心肌细胞界限清晰，结构正常；力竭后24 h，T组的心肌细胞界限较模糊，可见少量心肌纤维断裂和间质水肿；N组心肌细胞界限清晰，无心肌纤维断裂，也无明显间质水肿。
, 百拇医药
2.3心肌P53和S100A4蛋白的表达 P53蛋白表达的积分光密度(IOD)C组为461.68±106.23，T组为700.94±60.15，N组为564.48±151.89。T组显著高于C组(P﹤0.05)，N组增高不显著(P﹥0.05)。S100A4蛋白表达的积分光密度，C组为313.29±256.85，T组为452.86±168.79，N组为610.72±283.09。T组呈高于C组趋势(P﹥0.05)，N组却显著高于C组(P﹤0.05)和略高于T组(P﹥0.05)。
3讨论
本实验在负重游泳训练过程中采用生泥鳅干预，小鼠力竭游泳时间延长达121.12%，与既往的研究报导一致[3，5]，无疑有必要实际应用和深入研究生泥鳅对运动机体的作用及机制。
长时间有氧疲劳运动将引发自由基产生脂质过氧化，运动力竭可引起心肌组织中自由基增多，进而造成心肌细胞损伤[6]。一旦组织损伤组织细胞破裂，原本存在于细胞内的物质能在血中被检测到，可用于反映组织损伤，其中血清CK-MB活性的升高与心肌损伤相关[7]。本实验力竭后24 h，单纯训练小鼠可见心肌细胞病理表现、CK-MB活性偏高，力竭运动对小鼠心肌产生了一定损害。血清CK活性随运动时间的延长显著增加[8]，而生泥鳅粉干预小鼠游泳时间延长，24 h后活性却明显降低，心肌细胞无明显病理现象，显然提高了小鼠对超运动负荷的适应，发挥了保护心肌作用，这与已有的保护肝脏研究报导有一致性[3]。其保护作用，势必与小鼠运动耐力提高密切相关。
, http://www.100md.com
细胞受损及其清除的另一种形式是细胞凋亡，p53蛋白是一种抑癌因子，可使内源性Bcl-2表达下调、Bax表达上调，降低Bcl-2/Bax比值，对调节细胞凋亡过程起重要作用[9]。张钧等报道，力竭性运动和过度训练心肌细胞P53表达迅速增高，作为转录因子激活对心肌细胞凋亡调节[10]。心肌细胞P53表达变化在一定程度上可对心肌细胞损伤凋亡情况反映。本实验中单纯训练并力竭运动小鼠心肌细胞P53表达显著增高，可知力竭运动导致心肌损伤的凋亡过程增强。而泥鳅干预使P53增高幅度低，喻示心肌细胞凋亡过程较弱，生泥鳅对超负荷心肌组织确有保护作用。
S100A4是一种钙结合蛋白、促肿瘤转移因子，与肿瘤的发生、发展及预后相关[11]。而其在心血管内皮和心肌表达，有促血管生成，对培养的心肌细胞促进生长和存活作用[12]。有报道，S100A4蛋白表达上调促进损伤心肌细胞生长和存活，抑制细胞凋亡[13]。S100A4与P53蛋白的C末端区域结合，影响其亚细胞定位及转录活性，对细胞凋亡过程调节[14]。大鼠每天跑台力竭训练10d后，心肌和血管内皮细胞空泡变性和心肌间质水肿等，可见血管内皮细胞凋亡特征，同时心肌和血管内皮细胞S100A4蛋白表达显著增高[4]。本研究显示，训练小鼠力竭24 h后心肌P53蛋白表达量增高，S100A4表达增高不明显，反应训练后一次力竭运动的心肌损害轻于反复力竭，但对抗P53降低心肌细胞凋亡损害能力较弱。而生泥鳅降低P53表达、增高S100A4表达，利于降低力竭运动后心肌细胞凋亡。
4结论
负荷游泳训练小鼠力竭24 h后心肌细胞有损害，P53表达上调和S100A4表达较弱，对抗心肌凋亡损害作用有限。生泥鳅干预明显提高运动耐力和降低力竭运动导致的心肌细胞损害，与上调S100A4调节使心肌细胞得到保护作用有关。
参考文献：
[1]钦传光，黄开勋，徐辉碧.泥鳅中的生物活性分子及其药理作用[J].中国生化药物杂志，2002，23(1)：47-48., 百拇医药(刘祥梅 施孟)