过表达Pitx3基因慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立(2)
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1.5蛋白免疫印迹法(Western Blotting) 培养的正常和过表达Pitx3的稳定细胞株，利用碧云天公司生产的蛋白裂解液裂解收集的细胞，并BCA法测定蛋白浓度，最后样品置于100℃变性10min，离心备用。处理好的样品经SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳、转膜、封闭和抗体孵育，最后置于Odyssey仪器扫描观察结果。
1.6慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3感染靶细胞后Pitx3蛋白表达鉴定及稳定细胞株的筛选 采用含10% FBS的DMEM培养基培养MES23.5细胞，待细胞密度生长至50%～60%时进行靶细胞感染。采用MOI值为10感染MES23.5细胞，感染72 h后，用含有终浓度为1.5 ug/ml嘌呤霉素的培养基传代筛选能够稳定表达Pitx3的细胞株，冻存备用。继续传代稳定细胞株，收集细胞western blotting方法检测Pitx3蛋白的过表达。
1.7统计分析 统计学分析采用多因素方差分析，P<0.05被认为差异具有显著意义。
2结果
2.1成功构建慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3质粒 琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR结果，发现在约900bp和9000bp处分别有明显的基因片段；构建出慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3质粒，用EcoRⅠ及SalⅠ酶切鉴定，结果显示在约900bp及9000bp处分别有两条明亮的条带；将上述酶切鉴定正确的重组克隆进行测序验证，测序结果经Blast验证，发现基因克隆完全正确，无点突变和缺失(图1)。
图1 PCR产物及双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图
M： Marker； 1：质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切产物； 2：PCR产物。
2.2成功包装制备慢病毒pLV-N-Flag-Pitx3及稳定细胞株的制备 将构建好的慢病毒载体质粒pLV-N-Flag-Pitx3与包装质粒一起转染293T细胞 ......
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