二磷酸盐诱导人骨巨细胞瘤单核基质细胞凋亡中的电镜应用
摘要：目的 通过电镜技术研究二磷酸盐对体外人骨巨细胞瘤(GCT)单核基质细胞(Stc)影响后细胞的超微结构变化，为GCT新的辅助治疗方案的确立提供初步的实验依据。方法 用胶原酶-Ⅱ消化法体外分离培养8例新鲜GCT标本进行分离培养获得原代Stc并进行传代；电镜观察实验组细胞核超微结构变化。结果 二磷酸盐作用48 h(100 μmol/L)后电镜观察到细胞胞质浓缩、核凝聚、核碎裂和凋亡小体形成。结论 在一定浓度范围内，二磷酸盐可抑制人GCT单核基质细胞增殖，诱导细胞凋亡，电镜技术在研究二磷酸盐对人GCT中Stc体外诱导凋亡研究中具有重要价值。
关键词：电镜；二磷酸盐；骨巨细胞瘤；单核基质细胞；细胞培养；凋亡
骨巨细胞瘤(GCT)是一种常见的具有潜在恶性的骨肿瘤，约占骨肿瘤发病的14%～16%[1]，多发生于干骺端，具有局部侵袭性破坏骨质、复发和转移的潜在恶性特征。目前多数GCT的治疗是病灶刮除加植骨，但其复发率很高。本实验通过电镜技术观察二膦酸盐对人Stc增殖和凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1一般资料 标本来源8例长骨骨巨细胞瘤手术标本由山西医科大学附属二院骨病科提供。所有标本均经病理切片诊断核实。
1.2方法
1.2.1骨巨细胞瘤单核基质细胞的分离培养及纯化，在无菌条件下取骨巨细胞瘤质脆软的部分(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)，用含青霉素(1 g/l)和链霉素(1 g/l)的无菌PBS液中浸泡3遍，至颜色淡白，在含15%胎牛血清的DMEM培养液中用眼科小剪刀轻轻剪碎，加入现配好的胶原酶Ⅱ(10 mg/ml)1 ml，吹吸数十次后，放入37℃水浴箱中，孵育50 min，然后使用200目滤网过滤，加入6～8 ml含15%胎牛血清DMEM，4℃ 1000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入3～4 ml含15%胎牛血清的DMEM，吹打均匀，将细胞接种到培养瓶中。将培养瓶放入37℃ 5% CO2细胞培养箱中8 h，弃去未贴壁细胞悬液，无菌PBS清洗2次，胰酶消化1～2 min，加入含15%胎牛血清的DMEM，吹打均匀后放入孵箱，重复2～3次可以达到纯化。
1.2.2倒置显微镜观察 培养过程中，定期用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况：分离培养的瘤细胞，在纯化以前可见大量未贴壁的血细胞，和少部分贴壁的多核巨细胞，胰酶消化2～3次后，多核巨细胞变少甚至消失。纯化的单核基质细胞呈上皮形，梭形或多角形，排列成束状或漩涡状，4～5 d长满传代，2～3 d换液。其中2例作长期培养，可以传25～30代，为期100 d。
1.2.3二膦酸盐对体外GCT单核基质细胞的影响
1.2.3.1普通光学显微镜动态观察实验组和对照组细胞数量、形态变化。
1.2.3.2透射电镜观察凋亡细胞经浓度为100 μmol/L二膦酸盐作用48 h后，用刮刀将其从瓶底刮下，3%戊二醛固定，再用1%锇酸固定，逐级酒精脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，透射电子显微镜下观察并摄影。
2 结果
二膦酸盐对体外GCT单核基质细胞的影响。
2.1普通光学显微镜观察 实验组Stc经一定浓度二膦酸盐(100 μmol/L)作用一定时间(48 h)后，细胞生长速度减慢，贴壁能力下降，细胞形态发生皱缩、伪足变少、细胞变圆，失去原有的多边形特点，体积变小，胞质密度增高，细胞核膜保持完整，染色质进行性固缩等变化。
2.2透射电镜观察 凋亡Stc经浓度为100 μmol/L二膦酸盐作用48 h后，细胞体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，染色质凝聚、固缩、边聚，部分出现核碎裂，细胞器结构基本完好，胞质出芽，凋亡小体形成，见图1。
3 讨论
3.1电镜在凋亡检测方法的综合选取中的优势 细胞发生凋亡是一种主动的死亡过程，呈现特有的有别于细胞坏死的形态学和生物化学变化特点。
形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。凋亡细胞的形态学变化有：凋亡早期的胞膜完整性未破坏，表现为膜发泡，芽生形成膜包裹的凋亡小体，内含完整的细胞器和核碎片。细胞变圆，失去原有的多边形特点，体积变小，胞质密度增高。细胞核膜保持完整，染色质进行性固缩，并向核周形成块状结构、致密小体，或边集于核膜内侧呈新月体形。坏死则多表现为细胞的肿胀变圆，早期胞膜破损，形成大小不一的碎片，而核的变化发生较晚。形态学上早期细胞凋亡明显不同于细胞坏死，但最终凋亡细胞和坏死细胞一样发生细胞膜的损伤。因此凋亡早期，细胞膜完整性及核固缩现象是判断细胞凋亡还是坏死的重要手段，常用的方法有丫啶橙-溴化乙啶双染及Giemsa染色等方法，而使用高倍率的电镜则可直接观察到细胞核固缩的变化。
3.2二膦酸盐诱导Stc凋亡效应 二膦酸盐的抗骨吸收的作用机制[2]可能为以下三点：①直接改变破骨细胞的形态学，使成熟破骨细胞的超微结构和形态发生变化，从而诱导破骨细胞凋亡；②与骨基质理化结合，抑制溶酶体酶以及前列腺素等的合成，导致破骨细胞功能下降；③直接抑制成骨细胞介导的细胞因子如IL-6、TNF的产生[3]，促使成骨细胞释放出可溶性因子，作用于破骨细胞的前体，防止破骨细胞的形成，为骨巨细胞瘤术后复发、转移的防治探索一条新的途径。该研究表明二磷酸盐很可能是一种潜在的有前途的治疗GCT的方法。
本实验研究中观察在一定浓度二磷酸盐(即100 μmol/L)下经过48 h诱导体外培养的GCT细胞凋亡，透射电镜观察凋亡小体及凋亡细胞细胞器超微变化：Stc经浓度为100 μmol/L二磷酸盐作用48 h后，细胞体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，染色质凝聚、固缩、边聚，部分出现核碎裂，细胞器结构基本完好，胞质出芽，可见凋亡小体形成，该方法从直观形态学角度提示Stc在体外经过一定浓度一定时间的二磷酸盐作用后可以发生细胞凋亡。
总之，凋亡检测方法很多，实验过程中很少全部应用，而电镜在凋亡检测方法的综合选取中的优势在于能为细胞凋亡研究提供更加直接丰富的图像信息，可清晰显示细胞膜完整性、核固缩现象、凋亡小体形成等，对观察凋亡细胞的细胞器水平变化有重要意义，因此通过电镜手段观察细胞凋亡形态学变化很有必要。
参考文献：
[1]Cowan RW，Singh G.Giant cell tumor of bone：a basic science perspective[J].Bone，2013，52(1)：238-246.
[2]Chen G，Deng C，Li YP.TGF-beta and BMP signaling in osteoblast differentiation andbone formation[J].Int J Biol Sci，2012，8(2)：272-288.
[3]Bose S，Roy M，Bandyopadhyay A.Recent advances in bone tissue engineering scaffolds[J].Trends Biotechnol，2012，30(10)：546-554.
编辑/翟辰万, 百拇医药(项东全 王小勇)
关键词：电镜；二磷酸盐；骨巨细胞瘤；单核基质细胞；细胞培养；凋亡
骨巨细胞瘤(GCT)是一种常见的具有潜在恶性的骨肿瘤，约占骨肿瘤发病的14%～16%[1]，多发生于干骺端，具有局部侵袭性破坏骨质、复发和转移的潜在恶性特征。目前多数GCT的治疗是病灶刮除加植骨，但其复发率很高。本实验通过电镜技术观察二膦酸盐对人Stc增殖和凋亡的影响。
1 资料与方法
1.1一般资料 标本来源8例长骨骨巨细胞瘤手术标本由山西医科大学附属二院骨病科提供。所有标本均经病理切片诊断核实。
1.2方法
1.2.1骨巨细胞瘤单核基质细胞的分离培养及纯化，在无菌条件下取骨巨细胞瘤质脆软的部分(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)，用含青霉素(1 g/l)和链霉素(1 g/l)的无菌PBS液中浸泡3遍，至颜色淡白，在含15%胎牛血清的DMEM培养液中用眼科小剪刀轻轻剪碎，加入现配好的胶原酶Ⅱ(10 mg/ml)1 ml，吹吸数十次后，放入37℃水浴箱中，孵育50 min，然后使用200目滤网过滤，加入6～8 ml含15%胎牛血清DMEM，4℃ 1000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入3～4 ml含15%胎牛血清的DMEM，吹打均匀，将细胞接种到培养瓶中。将培养瓶放入37℃ 5% CO2细胞培养箱中8 h，弃去未贴壁细胞悬液，无菌PBS清洗2次，胰酶消化1～2 min，加入含15%胎牛血清的DMEM，吹打均匀后放入孵箱，重复2～3次可以达到纯化。
1.2.2倒置显微镜观察 培养过程中，定期用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况：分离培养的瘤细胞，在纯化以前可见大量未贴壁的血细胞，和少部分贴壁的多核巨细胞，胰酶消化2～3次后，多核巨细胞变少甚至消失。纯化的单核基质细胞呈上皮形，梭形或多角形，排列成束状或漩涡状，4～5 d长满传代，2～3 d换液。其中2例作长期培养，可以传25～30代，为期100 d。
1.2.3二膦酸盐对体外GCT单核基质细胞的影响
1.2.3.1普通光学显微镜动态观察实验组和对照组细胞数量、形态变化。
1.2.3.2透射电镜观察凋亡细胞经浓度为100 μmol/L二膦酸盐作用48 h后，用刮刀将其从瓶底刮下，3%戊二醛固定，再用1%锇酸固定，逐级酒精脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，透射电子显微镜下观察并摄影。
2 结果
二膦酸盐对体外GCT单核基质细胞的影响。
2.1普通光学显微镜观察 实验组Stc经一定浓度二膦酸盐(100 μmol/L)作用一定时间(48 h)后，细胞生长速度减慢，贴壁能力下降，细胞形态发生皱缩、伪足变少、细胞变圆，失去原有的多边形特点，体积变小，胞质密度增高，细胞核膜保持完整，染色质进行性固缩等变化。
2.2透射电镜观察 凋亡Stc经浓度为100 μmol/L二膦酸盐作用48 h后，细胞体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，染色质凝聚、固缩、边聚，部分出现核碎裂，细胞器结构基本完好，胞质出芽，凋亡小体形成，见图1。
3 讨论
3.1电镜在凋亡检测方法的综合选取中的优势 细胞发生凋亡是一种主动的死亡过程，呈现特有的有别于细胞坏死的形态学和生物化学变化特点。
形态学是鉴定细胞凋亡最可靠的方法。凋亡细胞的形态学变化有：凋亡早期的胞膜完整性未破坏，表现为膜发泡，芽生形成膜包裹的凋亡小体，内含完整的细胞器和核碎片。细胞变圆，失去原有的多边形特点，体积变小，胞质密度增高。细胞核膜保持完整，染色质进行性固缩，并向核周形成块状结构、致密小体，或边集于核膜内侧呈新月体形。坏死则多表现为细胞的肿胀变圆，早期胞膜破损，形成大小不一的碎片，而核的变化发生较晚。形态学上早期细胞凋亡明显不同于细胞坏死，但最终凋亡细胞和坏死细胞一样发生细胞膜的损伤。因此凋亡早期，细胞膜完整性及核固缩现象是判断细胞凋亡还是坏死的重要手段，常用的方法有丫啶橙-溴化乙啶双染及Giemsa染色等方法，而使用高倍率的电镜则可直接观察到细胞核固缩的变化。
3.2二膦酸盐诱导Stc凋亡效应 二膦酸盐的抗骨吸收的作用机制[2]可能为以下三点：①直接改变破骨细胞的形态学，使成熟破骨细胞的超微结构和形态发生变化，从而诱导破骨细胞凋亡；②与骨基质理化结合，抑制溶酶体酶以及前列腺素等的合成，导致破骨细胞功能下降；③直接抑制成骨细胞介导的细胞因子如IL-6、TNF的产生[3]，促使成骨细胞释放出可溶性因子，作用于破骨细胞的前体，防止破骨细胞的形成，为骨巨细胞瘤术后复发、转移的防治探索一条新的途径。该研究表明二磷酸盐很可能是一种潜在的有前途的治疗GCT的方法。
本实验研究中观察在一定浓度二磷酸盐(即100 μmol/L)下经过48 h诱导体外培养的GCT细胞凋亡，透射电镜观察凋亡小体及凋亡细胞细胞器超微变化：Stc经浓度为100 μmol/L二磷酸盐作用48 h后，细胞体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，染色质凝聚、固缩、边聚，部分出现核碎裂，细胞器结构基本完好，胞质出芽，可见凋亡小体形成，该方法从直观形态学角度提示Stc在体外经过一定浓度一定时间的二磷酸盐作用后可以发生细胞凋亡。
总之，凋亡检测方法很多，实验过程中很少全部应用，而电镜在凋亡检测方法的综合选取中的优势在于能为细胞凋亡研究提供更加直接丰富的图像信息，可清晰显示细胞膜完整性、核固缩现象、凋亡小体形成等，对观察凋亡细胞的细胞器水平变化有重要意义，因此通过电镜手段观察细胞凋亡形态学变化很有必要。
参考文献：
[1]Cowan RW，Singh G.Giant cell tumor of bone：a basic science perspective[J].Bone，2013，52(1)：238-246.
[2]Chen G，Deng C，Li YP.TGF-beta and BMP signaling in osteoblast differentiation andbone formation[J].Int J Biol Sci，2012，8(2)：272-288.
[3]Bose S，Roy M，Bandyopadhyay A.Recent advances in bone tissue engineering scaffolds[J].Trends Biotechnol，2012，30(10)：546-554.
编辑/翟辰万, 百拇医药(项东全 王小勇)