两种不同的检验方法检测乙型肝炎病毒标志物的临床比较
摘要：目的 对比时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)检测乙型肝炎病毒标志物效用。方法 对272例对象进行有关于HBV血清标志物TRFIA、CLIA检测。结果 TRFIA检验HBcAb阳性率高于ECLIA，TRFIA检测HBsAb特异度、检测HBeAg与HBcAb灵敏度低于ECLIA方法，TRFIA检测HBeAg特异度、检测HBcAb特异度高于ECLIA，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 TRFIA、CLIA检测各有优劣。
关键词：乙型肝炎；病毒标志物；化学发光免疫；时间分辨荧光免疫分析
乙型病毒性肝炎(以下简称乙肝)，是一种严重威胁人类生命健康的病毒性传染病，保守估计全世界约20亿人感染过乙型肝炎病毒(HBV)，现存慢性HBV感染者约3.5亿人。我国乙肝表面抗原携带率高达8%～10%[1]。乙肝危害极大，约50%～70%的慢性HBV感染者进展为慢性肝炎，其中多数又进展为肝硬化、肝癌，年死亡约100万例[2]。检测HBV病毒标志物是乙肝防治基础工作之一，可反映乙肝发展、转归以及预后。HBV标志物检测主要可分为定性分析与定量分析，定量分析主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、TRFIA、CLIA等，国内常用Elecsys Ⅱ系统、Architect系统，ELISA法应用最广[3]。CLIA、TRFIA灵敏度高，特异性好，可进行定量分析，但目前在临床上应用较少，关于两种方法优劣尚无明确定量。
1 资料与方法
1.1一般资料 以2014年1月～2015年1月，医院开展HBV 血清标志物定量检测受检者作为研究对象。纳入标准：①知情同意；②严格质控。共纳入对象272例，其中男150例、女122例，年龄1～84岁、平均(41.3±5.2)岁。50例诊断为肝炎，已知FQ-HBV-DNA定量检测结果。其余均为日常检验样本。
1.2方法 采用CLIA双抗夹心法检测HbsAg、双抗原夹心法检测HbsAb、双抗体夹心法检测HbeAg、竞争法检测HbeAb、HbcAb。检查仪器，检测HBsAg四项血清标志物配套试剂，读取试剂盒上条形信息。先检测2份质控品，若检测值在要求范围内，开始检测待测样品，否则需排除失控原因再检测。
TRFIL双抗体夹心法检测HBsAg、双抗原夹心法检测HbsAb/双抗体夹心法检测HbeAg、竞争法检测HBeAb与HbcAb。采用铕标志，将稀释液按1：50配置成为事项HBV血清标注物标记物工作液，同时将相应的微孔反应板、空白板，按顺序放置在时间分娩荧光分析仪固定的反应板位置，将配套的校准液、质控品等放置于预设位置。复融血清标本，吸取500μl，采用EFFICUTA全自动样本处理系统加样，仪器缓慢振动孵育40min，洗板，加入铕标志物工作液，加增强液，仪器自动根据校准品浓度与荧光值，采用拟合方式计算标准曲线，而后求出待测样本浓度，进而判断结果。
以荧光PCR定量检测为金标准，抽提HBV-DNA模板，配置PCR反映液，并向每个PCR反应管中加入20μl，加入DNA模块液，进行PCR扩增。
1.3判断标准 CLIA法：HBsAg、HBeAg≥1.0 COI者为阳性，否则为阴性；HBeAb、HBcAb<1.0COI为阳性，否则为阴性；HBsAb≥10mIU/ml者为阳性，否则为阴性。
TRFIL法：HBsAg≥0.2ng/ml者为阳性，否则为阴性；HBsAb≥10mIU/ml者为阳性，否则为阴性；HBeAg≥0.5PEIU/ml者为阳性，否则为阴性；HBeAb≥0.2PEI U/ml者为阳性，否则为阴性；HBcAb≥0.9PEI U/ml者为阳性，否则为阴性。
1.4统计学处理 WPS收集录入数据资料，以SPSS18.0软件包统计处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，若服从正态分布采用t检验，否则采用非参数检验，计数资料以数(n)或率(%)表示，比较采用χ2检验，以P<0.05表示检验水平，一致性检验采用Kappa分析，Kappa>0.75表示有较好的一致性。
2 结果
2.1两种方法检验结果分布 TRFIA检验HBcAb阳性率高于ECLIA，差异具有统计学意义(P<0.05)；TRFIA与ECLIA方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb阳性率差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。两种方法一致性检验，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb一致性Kappa值分别为0.932、0.805、0.890、0.844、0.450，其中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb具有较好的一致性。
2.2检测HBV血清标志物效用 以PCR检测结果为金标准，HBsAb阳性147例、HBeAg阳性31、HBeAb阳性150例、HBcAb阳性195例。TRFIA检测HBsAb特异度、检测HBeAg与HBcAb灵敏度低于ECLIA方法，TRFIA检测HBeAg特异度、检测HBcAb特异度高于ECLIA，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。
3 讨论
目前，临床普遍采用ELISA检测HBV血清标志物，近年来TRFIA与ECLIA法迅速发展，并逐渐得到推广应用，普遍认为两种方法并无优劣之分，都可有效对HBV血清标志物水平，进行定量分析。但从本次研究来看，两种技术对不同类型HBV血清标志物敏感性、特异度不尽相同，TRFIA法对HBeAg与HBcAb敏感性、对HBeAb特异度偏低，ECLIA法对HBeAb于HBcAb特异度偏低。TRFIA以铕为示踪剂，可明显排除非特异性荧光的干扰，当具有双功能基团的铕标记抗原或抗体与病毒血清抗体与抗原结合时，可在特定的激发光下发出特定波长的荧光。CLIA技术是目前最先进的化学发光免疫测定系统之一，从方法学角度来看，但该法检测效用易受血清稀释比例、操作步骤影响。ECLIA、TRFIA检测不同HBV血清标志物效用差异具体原因尚不清楚，可能与技术实现特定、步骤差异、材料质量等因素有关，实验室应据、检测水平，制定合适的血清标志物筛查诊断HBV感染流程步骤。
综上所述，TRFIA、CLIA检测各有优劣，对HBsAb敏感度较高。
参考文献：
[1]中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中国预防医学杂志，2011，12(1)：1-15.
[2]林宇，李颂华，王如伟.日本对慢性乙型肝炎和肝硬化的治疗研究概述[J].中国药学杂志，2012，47(18)：1444-1449.
[3]马晓燕，韩涛，裴彦祯，等.乙肝肝硬化患者血清乙肝病毒表面抗原定量水平的研究[J].中国现代医学杂志，2011，21(34)：4375-4277.
编辑/金昊天, http://www.100md.com(赵桂金)
关键词：乙型肝炎；病毒标志物；化学发光免疫；时间分辨荧光免疫分析
乙型病毒性肝炎(以下简称乙肝)，是一种严重威胁人类生命健康的病毒性传染病，保守估计全世界约20亿人感染过乙型肝炎病毒(HBV)，现存慢性HBV感染者约3.5亿人。我国乙肝表面抗原携带率高达8%～10%[1]。乙肝危害极大，约50%～70%的慢性HBV感染者进展为慢性肝炎，其中多数又进展为肝硬化、肝癌，年死亡约100万例[2]。检测HBV病毒标志物是乙肝防治基础工作之一，可反映乙肝发展、转归以及预后。HBV标志物检测主要可分为定性分析与定量分析，定量分析主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、TRFIA、CLIA等，国内常用Elecsys Ⅱ系统、Architect系统，ELISA法应用最广[3]。CLIA、TRFIA灵敏度高，特异性好，可进行定量分析，但目前在临床上应用较少，关于两种方法优劣尚无明确定量。
1 资料与方法
1.1一般资料 以2014年1月～2015年1月，医院开展HBV 血清标志物定量检测受检者作为研究对象。纳入标准：①知情同意；②严格质控。共纳入对象272例，其中男150例、女122例，年龄1～84岁、平均(41.3±5.2)岁。50例诊断为肝炎，已知FQ-HBV-DNA定量检测结果。其余均为日常检验样本。
1.2方法 采用CLIA双抗夹心法检测HbsAg、双抗原夹心法检测HbsAb、双抗体夹心法检测HbeAg、竞争法检测HbeAb、HbcAb。检查仪器，检测HBsAg四项血清标志物配套试剂，读取试剂盒上条形信息。先检测2份质控品，若检测值在要求范围内，开始检测待测样品，否则需排除失控原因再检测。
TRFIL双抗体夹心法检测HBsAg、双抗原夹心法检测HbsAb/双抗体夹心法检测HbeAg、竞争法检测HBeAb与HbcAb。采用铕标志，将稀释液按1：50配置成为事项HBV血清标注物标记物工作液，同时将相应的微孔反应板、空白板，按顺序放置在时间分娩荧光分析仪固定的反应板位置，将配套的校准液、质控品等放置于预设位置。复融血清标本，吸取500μl，采用EFFICUTA全自动样本处理系统加样，仪器缓慢振动孵育40min，洗板，加入铕标志物工作液，加增强液，仪器自动根据校准品浓度与荧光值，采用拟合方式计算标准曲线，而后求出待测样本浓度，进而判断结果。
以荧光PCR定量检测为金标准，抽提HBV-DNA模板，配置PCR反映液，并向每个PCR反应管中加入20μl，加入DNA模块液，进行PCR扩增。
1.3判断标准 CLIA法：HBsAg、HBeAg≥1.0 COI者为阳性，否则为阴性；HBeAb、HBcAb<1.0COI为阳性，否则为阴性；HBsAb≥10mIU/ml者为阳性，否则为阴性。
TRFIL法：HBsAg≥0.2ng/ml者为阳性，否则为阴性；HBsAb≥10mIU/ml者为阳性，否则为阴性；HBeAg≥0.5PEIU/ml者为阳性，否则为阴性；HBeAb≥0.2PEI U/ml者为阳性，否则为阴性；HBcAb≥0.9PEI U/ml者为阳性，否则为阴性。
1.4统计学处理 WPS收集录入数据资料，以SPSS18.0软件包统计处理，计量资料采用均数±标准差(x±s)表示，若服从正态分布采用t检验，否则采用非参数检验，计数资料以数(n)或率(%)表示，比较采用χ2检验，以P<0.05表示检验水平，一致性检验采用Kappa分析，Kappa>0.75表示有较好的一致性。
2 结果
2.1两种方法检验结果分布 TRFIA检验HBcAb阳性率高于ECLIA，差异具有统计学意义(P<0.05)；TRFIA与ECLIA方法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb阳性率差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。两种方法一致性检验，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb一致性Kappa值分别为0.932、0.805、0.890、0.844、0.450，其中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb具有较好的一致性。
2.2检测HBV血清标志物效用 以PCR检测结果为金标准，HBsAb阳性147例、HBeAg阳性31、HBeAb阳性150例、HBcAb阳性195例。TRFIA检测HBsAb特异度、检测HBeAg与HBcAb灵敏度低于ECLIA方法，TRFIA检测HBeAg特异度、检测HBcAb特异度高于ECLIA，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。
3 讨论
目前，临床普遍采用ELISA检测HBV血清标志物，近年来TRFIA与ECLIA法迅速发展，并逐渐得到推广应用，普遍认为两种方法并无优劣之分，都可有效对HBV血清标志物水平，进行定量分析。但从本次研究来看，两种技术对不同类型HBV血清标志物敏感性、特异度不尽相同，TRFIA法对HBeAg与HBcAb敏感性、对HBeAb特异度偏低，ECLIA法对HBeAb于HBcAb特异度偏低。TRFIA以铕为示踪剂，可明显排除非特异性荧光的干扰，当具有双功能基团的铕标记抗原或抗体与病毒血清抗体与抗原结合时，可在特定的激发光下发出特定波长的荧光。CLIA技术是目前最先进的化学发光免疫测定系统之一，从方法学角度来看，但该法检测效用易受血清稀释比例、操作步骤影响。ECLIA、TRFIA检测不同HBV血清标志物效用差异具体原因尚不清楚，可能与技术实现特定、步骤差异、材料质量等因素有关，实验室应据、检测水平，制定合适的血清标志物筛查诊断HBV感染流程步骤。
综上所述，TRFIA、CLIA检测各有优劣，对HBsAb敏感度较高。
参考文献：
[1]中华医学会感染病学分会，中华医学会肝病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中国预防医学杂志，2011，12(1)：1-15.
[2]林宇，李颂华，王如伟.日本对慢性乙型肝炎和肝硬化的治疗研究概述[J].中国药学杂志，2012，47(18)：1444-1449.
[3]马晓燕，韩涛，裴彦祯，等.乙肝肝硬化患者血清乙肝病毒表面抗原定量水平的研究[J].中国现代医学杂志，2011，21(34)：4375-4277.
编辑/金昊天, http://www.100md.com(赵桂金)