快速冰冻免疫组化染色诊断阴道恶性黑色素瘤1例及其应用价值(2)
术中送检的组织标本进行快速冰冻制片后，经95%乙醇固定2 min，稍水洗，3%H2O2 2 min，PBS 1 min ×3次，分别滴加HMB45和MalanA一抗，37°C孵育20 min，PBS 1 min ×3次，然后滴加快捷型二抗，37°C孵育8 min，PBS稍洗后，滴加DAB显色2 min，稍水洗后进行复染，常规脱水透明后封片，整个染色过程共约35～40 min。
1.2.2石蜡组织切片染色 组织标本固定于10%中性福尔马林，经脱水、透明、浸蜡后，石蜡包埋、常规切片、HE染色。
1.2.3石蜡组织切片免疫组织化学染色 免疫组化染色一抗HMB45为中杉金桥公司的ZM-0187鼠单抗，MelanA为中杉金桥公司的ZM-0398鼠单抗，二抗为深达生物公司的DD-13免疫显色试剂，显色试剂同冰冻免疫组化。常规石蜡切片后65°C烤片1 h，透明剂5 min×3脱蜡，无水乙醇3 min×3，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，水洗，EDTA(PH8.0)热修复95°C，3 min，待冷却后经3%H2O2封闭10 min，流水冲洗，PBS 3 min×3，然后滴加一抗，37°C孵育1 h，PBS 3 min×3，然后滴二抗，室温孵育30 min，PBS 3 min×3，滴加DAB显色2 min，稍水洗后进行复染，常规脱水透明后封片，整个染色过程约4～5 h。
, 百拇医药
2结果
2.1快速冰冻切片HE及免疫组化染色：HE染色细胞异型小，恶性黑色素瘤形态不典型，HMB45和MelanA部分细胞呈阳性表达，定位于细胞浆，见图2。
1.2石蜡切片HE染色结果 镜下见大部分区域肿瘤细胞较小，异型性小，圆形或多角形，上皮样，部分细胞胞浆空亮，少部分细胞内可见黑色素颗粒；零件少部分区域细胞呈梭形，异型性较大，部分细胞浆内可见黑色素颗粒，见图3。病理诊断：阴道黑色素瘤，结节样恶性黑色素瘤；Breslow厚度：1.3 cm；Clark水平：Ⅳ；有水平(放射状)生长、垂直生长及溃疡，核分裂像1～4个/2mm2，无退化，淋巴细胞浸润不明显，周围切缘及深部切缘阴性，见微卫星灶，有血管浸润，无神经浸润；AJCC分期：T4bN2aMx。
2.3石蜡切片免疫组化染色结果 MelanA和HMB45染色，肿瘤细胞均阳性；其中AEC显色，阳性结果呈红色；DAB显色，阳性结果为呈棕黄色；细胞内色素呈棕至棕黑色，细胞核均呈蓝色，见图4。
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2讨论
恶性黑色素瘤是来源于黑色素细胞的一种高度恶性肿瘤[1]，原发于女性生殖道的恶性黑色素瘤少见，仅占全部恶性黑色素瘤的3%～5%[2]。1887 年Poronas 首次报道了原发性陰道恶性黑色素瘤，至今这种病例只有少数个案报道及病例分析，全球的病例报道文献不足300 例[3]，该疾病恶性度高，易发生复发转移，其5年生存率约为25%[4]。目前，手术仍是阴道恶性黑色素瘤首选治疗方案，能有效延长患者生存时间[5]。此外，早期发现有助于延长患者的存活时间，因此对恶性黑色素瘤病理诊断分析的准确性显得极为重要，掌握恶性黑色素瘤病理诊断特点，有助于临床治疗和患者预后。免疫组织化学染色中，恶性黑色素瘤肿瘤细胞不同程度地表达黑色素细胞标志物S-100、HMB45和MelanA，由于各标志物的敏感性和特异性不同，故采用至少两种标志物联合检测，可提高恶性黑色素瘤的诊断准确性[6]。本病例因冰冻送检组织小，镜下恶性黑色素瘤细胞形态不典型，异型性小，且患者年龄较大，无法耐受二次手术，所以需行快速冰冻免疫组化以明确诊断，选取HMB45和MelanA两种抗体联合使用。我们所用的快速冰冻免疫组化只需35～40 min就能完成染色过程，对于术中需要明确诊断，尤其是明确良恶性诊断的病例具有重要的临床意义和应用价值，但并不是所有用于石蜡免疫组化的抗体，均适用于快速冰冻免疫组化，因此我们也在进一步研究和探讨更多适用于快速冰冻免疫组化的指标。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]周茜，黄绮，姚晓虹，等.29例皮肤恶性黑色素瘤临床病理分析[J].中国医药指南，2008，6(9)：20.
[2]Weinstock M A.Malignant melanoma of the vulva and vagina in the united states：Patterns of incidence and opulatin-based estimates of survival[J].Am J Obstet Gyneeol，1994，171(5)：1225-30.
[3]Charlotte Vaysse，Patricia Pautier，Thomas Filleron，et al.A large retrospective multicenter study of vagina melanomas：implications for new management[J].Melanoma Research，2013，23(2)：138-146.
, 百拇医药
[4]Tcheung W J，Selim M A，Nd H J，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].Journal of the American Academy of Dermatology，2012，67(4)：598.
[5]Fmmovitz M，Etchepareborda M，Sun CC，et al.Primary malignant melanoma of the vagina[J].Obstet Gynecol，2010，116(6)：1358-1365.
[6]Tcheung W J，Selim M A，Herndon J N，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].J Am Acad Dermatol，2012，67(4)：598-605.编辑/高章利, 百拇医药(宋剑婵 司婧文 陈凌 张新莹 师宜荃 刘易欣)
1.2.2石蜡组织切片染色 组织标本固定于10%中性福尔马林，经脱水、透明、浸蜡后，石蜡包埋、常规切片、HE染色。
1.2.3石蜡组织切片免疫组织化学染色 免疫组化染色一抗HMB45为中杉金桥公司的ZM-0187鼠单抗，MelanA为中杉金桥公司的ZM-0398鼠单抗，二抗为深达生物公司的DD-13免疫显色试剂，显色试剂同冰冻免疫组化。常规石蜡切片后65°C烤片1 h，透明剂5 min×3脱蜡，无水乙醇3 min×3，95%乙醇3 min，80%乙醇3 min，水洗，EDTA(PH8.0)热修复95°C，3 min，待冷却后经3%H2O2封闭10 min，流水冲洗，PBS 3 min×3，然后滴加一抗，37°C孵育1 h，PBS 3 min×3，然后滴二抗，室温孵育30 min，PBS 3 min×3，滴加DAB显色2 min，稍水洗后进行复染，常规脱水透明后封片，整个染色过程约4～5 h。
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2结果
2.1快速冰冻切片HE及免疫组化染色：HE染色细胞异型小，恶性黑色素瘤形态不典型，HMB45和MelanA部分细胞呈阳性表达，定位于细胞浆，见图2。
1.2石蜡切片HE染色结果 镜下见大部分区域肿瘤细胞较小，异型性小，圆形或多角形，上皮样，部分细胞胞浆空亮，少部分细胞内可见黑色素颗粒；零件少部分区域细胞呈梭形，异型性较大，部分细胞浆内可见黑色素颗粒，见图3。病理诊断：阴道黑色素瘤，结节样恶性黑色素瘤；Breslow厚度：1.3 cm；Clark水平：Ⅳ；有水平(放射状)生长、垂直生长及溃疡，核分裂像1～4个/2mm2，无退化，淋巴细胞浸润不明显，周围切缘及深部切缘阴性，见微卫星灶，有血管浸润，无神经浸润；AJCC分期：T4bN2aMx。
2.3石蜡切片免疫组化染色结果 MelanA和HMB45染色，肿瘤细胞均阳性；其中AEC显色，阳性结果呈红色；DAB显色，阳性结果为呈棕黄色；细胞内色素呈棕至棕黑色，细胞核均呈蓝色，见图4。
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2讨论
恶性黑色素瘤是来源于黑色素细胞的一种高度恶性肿瘤[1]，原发于女性生殖道的恶性黑色素瘤少见，仅占全部恶性黑色素瘤的3%～5%[2]。1887 年Poronas 首次报道了原发性陰道恶性黑色素瘤，至今这种病例只有少数个案报道及病例分析，全球的病例报道文献不足300 例[3]，该疾病恶性度高，易发生复发转移，其5年生存率约为25%[4]。目前，手术仍是阴道恶性黑色素瘤首选治疗方案，能有效延长患者生存时间[5]。此外，早期发现有助于延长患者的存活时间，因此对恶性黑色素瘤病理诊断分析的准确性显得极为重要，掌握恶性黑色素瘤病理诊断特点，有助于临床治疗和患者预后。免疫组织化学染色中，恶性黑色素瘤肿瘤细胞不同程度地表达黑色素细胞标志物S-100、HMB45和MelanA，由于各标志物的敏感性和特异性不同，故采用至少两种标志物联合检测，可提高恶性黑色素瘤的诊断准确性[6]。本病例因冰冻送检组织小，镜下恶性黑色素瘤细胞形态不典型，异型性小，且患者年龄较大，无法耐受二次手术，所以需行快速冰冻免疫组化以明确诊断，选取HMB45和MelanA两种抗体联合使用。我们所用的快速冰冻免疫组化只需35～40 min就能完成染色过程，对于术中需要明确诊断，尤其是明确良恶性诊断的病例具有重要的临床意义和应用价值，但并不是所有用于石蜡免疫组化的抗体，均适用于快速冰冻免疫组化，因此我们也在进一步研究和探讨更多适用于快速冰冻免疫组化的指标。
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参考文献：
[1]周茜，黄绮，姚晓虹，等.29例皮肤恶性黑色素瘤临床病理分析[J].中国医药指南，2008，6(9)：20.
[2]Weinstock M A.Malignant melanoma of the vulva and vagina in the united states：Patterns of incidence and opulatin-based estimates of survival[J].Am J Obstet Gyneeol，1994，171(5)：1225-30.
[3]Charlotte Vaysse，Patricia Pautier，Thomas Filleron，et al.A large retrospective multicenter study of vagina melanomas：implications for new management[J].Melanoma Research，2013，23(2)：138-146.
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[4]Tcheung W J，Selim M A，Nd H J，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].Journal of the American Academy of Dermatology，2012，67(4)：598.
[5]Fmmovitz M，Etchepareborda M，Sun CC，et al.Primary malignant melanoma of the vagina[J].Obstet Gynecol，2010，116(6)：1358-1365.
[6]Tcheung W J，Selim M A，Herndon J N，et al.Clinicopathologic study of 85 cases of melanoma of the female genitalia[J].J Am Acad Dermatol，2012，67(4)：598-605.编辑/高章利, 百拇医药(宋剑婵 司婧文 陈凌 张新莹 师宜荃 刘易欣)
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