手足口病患儿血清淋巴细胞免疫分型的水平变化及临床意义(2)
1.2仪器与试剂 用BD(Becton-Dick-inson)公司生产的FACSCaLibur流式细胞仪检测仪器测定淋巴细胞免疫分型水平：淋巴细胞数(L)、T淋巴细胞百分比(CD3%)、CD8淋巴细胞百分比(CD8%)、CD4淋巴细胞百分比(CD4%)、CD4CD8均阳比例(CD4+CD8+%)、NK细胞百分比(CD16%)、B淋巴细胞百分比(CD19%)、T淋巴细胞计数(CD3)、CD8淋巴细胞计数(CD8)、CD4淋巴细胞计数(CD4)、CD4CD8均阳计数、NK细胞计数(CD16)、B淋巴细胞计数(CD19)、CD4/CD8。
1.3收集血清样本方法 抽取实验儿童外周静脉血2.5 ml，放置在加用肝素抗凝真空试剂管中，充分混匀抗凝。放置在室内，避光放置。抽取样本采用Multiset四色免洗淋巴细胞亚群的绝对数方法，具体方法：①每个样本取2支Trucount管，分别标号A和B管；②分别在A管中加入10 μl的CD3/CD8/CD4/CD5抗体，B管中加入10 μl的CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗体；③用反向加样法分别向A、B管中加入50 μl颠倒混匀的抗凝全血，然后涡旋混匀，室温下避光15 min；④分别向A、B管中加入450 μl 1×FACS溶血素，充分混匀，室温下放置10 min；⑤24 h内上述样本上机检测，用Mutiset软件检测分析。
, 百拇医药
1.4统计学处理 采用统计软件SPSS18对采集得出数据进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，同时对其数据行正态性检验，组间统计资料符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用方差分析检验，以P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
重症组中淋巴细胞数(L)、T淋巴细胞百分比(CD3%)、CD8淋巴細胞百分比(CD8%)、CD4淋巴细胞百分比(CD4%)、CD4CD8均阳比例(CD4+CD8+%)、NK细胞百分比(CD16%)、B淋巴细胞百分比(CD19%)、T淋巴细胞计数(CD3)、CD8淋巴细胞计数(CD8)、CD4淋巴细胞计数(CD4)、CD4CD8均阳计数、NK细胞计数(CD16)、B淋巴细胞计数(CD19)、CD4/CD8值均低于轻症组，轻症组较健康组低，见表1～表4。根据方差分析得出差异有统计学意义。
3讨论
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手足口病在我国处于高发状态，患儿感染如柯萨奇病毒等肠道病毒后，常见在口腔与皮肤上出现疱疹及丘疹，但是随着病情的进展可出现全身炎症反应综合征，严重可导致多器官功能衰竭。免疫低下患儿感染，常迅速发展为重型手足口病；因此检测患者免疫功能尤为重要[1，3，5]。机体免疫功能在手足口患儿疾病发生发展以及病情进展中发生常见作用，随着大量临床研究显示，淋巴细胞亚群改变导致机体免疫功能受损可能同手足口病情进展有相关性。目前研究最多是T细胞亚群[2，4，6-8]。
血清中T淋巴细胞来源骨髓，成熟器官为胸腺。T淋巴细胞的特有标志为TCR-CD3[T细胞(抗原)受体与CD3分子复合物]。T淋巴细胞根据其表面标志和功能特性，可以分为CD3+CD8+的抑制性T淋巴细胞(CTL)以及CD3+CD4+的辅助性T淋巴细胞(CD4+Th)。CTL细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素、通过FasL途径等导致靶细胞的分解机凋亡[2，6，8-10]。CD4+Th细胞可继续分化为分泌型的Th细胞亚群：Th1细胞、Th2细胞、Th3细胞和Th17细胞。正常状态下，T淋巴细胞亚群数量处于一个动态平衡并且相互调节的状态。其值降低说明机体处于免疫抑制状态，易受细菌及病毒、原虫、真菌等因素感染[6，9，10-14]。
, http://www.100md.com
此临床研究显示，重症组患儿血清中L、CD3%、CD8%、CD4%、CD16%、CD19%、CD3、CD8、CD4、CD16、CD19、CD4/CD8值明显低于轻症组，较健康组低，轻症组较健康组低，说明病情随着病情加重，细胞免疫功能处于明显抑制状态。其机制为：①当机体遭受手足口病毒感染，如柯萨奇病毒等后，T淋巴细胞对病毒抗原刺激无增殖性反应，T淋巴细胞产生分裂及凋亡。使大量活化的T淋巴细胞遭到清除，并且诱导T淋巴细胞克隆无反应，机体特异性免疫受到抑制[9，11，12-15]；②T淋巴细胞分化异常，CTL及CD4+Th不处于动态平衡，从而使分泌细胞因子及炎症介质，如IL-1、6、8、10，干扰素等分泌减少，使体液免疫功能受损，结果使机体清除病原体无力，病情恶化[1，5，9，12]。本研究还显示，重症组比轻症组免疫功能障碍更严重，从而说明患者病情越严重，机体的免疫功能抑制越严重，患者的预后更差。当然，由于条件所限，未能同时进行如免疫球蛋白，补体等的检测是本研究的不足之处，如能进行，将会对患儿的免疫功能监测更客观和全面。
综上所述，尽早对血清淋巴细胞亚群检测，对患儿病情的判断、临床治疗的指导具有重要意义。
, 百拇医药
参考文献：
[1]卫生部.手足口病诊疗指南[M].北京：人民卫生出版社，2012：1-5.
[2]中华人民共和国卫生部.卫生部办公厅关于印发《手足口病诊疗指南(2010年版)》的通知[EB/OL].[2016-05-01].http：//www.moh.gov.cn/mohyzs/s3586/201004/46884.shtml.
[3]李国伟，陈巧格，王万民，等.2013-2015年郑州市重症手足口病流行特征分析[J].职业与健康，2016，32(15)：2107-2109.
[4]Stock I.Hand，foot and mouth disease more than a harmless"childhood disease"[J].Med Monatsschr Pharm，2014，37(1)：4-10.
[5]Hongyan G，Chengjie M，Qiaozhi Y，et al.Hand，foot and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Beijing，2013[J].Pediatr Infect Dis J，2014，33(12)：1302-1303., 百拇医药(任燕)
1.3收集血清样本方法 抽取实验儿童外周静脉血2.5 ml，放置在加用肝素抗凝真空试剂管中，充分混匀抗凝。放置在室内，避光放置。抽取样本采用Multiset四色免洗淋巴细胞亚群的绝对数方法，具体方法：①每个样本取2支Trucount管，分别标号A和B管；②分别在A管中加入10 μl的CD3/CD8/CD4/CD5抗体，B管中加入10 μl的CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗体；③用反向加样法分别向A、B管中加入50 μl颠倒混匀的抗凝全血，然后涡旋混匀，室温下避光15 min；④分别向A、B管中加入450 μl 1×FACS溶血素，充分混匀，室温下放置10 min；⑤24 h内上述样本上机检测，用Mutiset软件检测分析。
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1.4统计学处理 采用统计软件SPSS18对采集得出数据进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，同时对其数据行正态性检验，组间统计资料符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采用方差分析检验，以P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
重症组中淋巴细胞数(L)、T淋巴细胞百分比(CD3%)、CD8淋巴細胞百分比(CD8%)、CD4淋巴细胞百分比(CD4%)、CD4CD8均阳比例(CD4+CD8+%)、NK细胞百分比(CD16%)、B淋巴细胞百分比(CD19%)、T淋巴细胞计数(CD3)、CD8淋巴细胞计数(CD8)、CD4淋巴细胞计数(CD4)、CD4CD8均阳计数、NK细胞计数(CD16)、B淋巴细胞计数(CD19)、CD4/CD8值均低于轻症组，轻症组较健康组低，见表1～表4。根据方差分析得出差异有统计学意义。
3讨论
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手足口病在我国处于高发状态，患儿感染如柯萨奇病毒等肠道病毒后，常见在口腔与皮肤上出现疱疹及丘疹，但是随着病情的进展可出现全身炎症反应综合征，严重可导致多器官功能衰竭。免疫低下患儿感染，常迅速发展为重型手足口病；因此检测患者免疫功能尤为重要[1，3，5]。机体免疫功能在手足口患儿疾病发生发展以及病情进展中发生常见作用，随着大量临床研究显示，淋巴细胞亚群改变导致机体免疫功能受损可能同手足口病情进展有相关性。目前研究最多是T细胞亚群[2，4，6-8]。
血清中T淋巴细胞来源骨髓，成熟器官为胸腺。T淋巴细胞的特有标志为TCR-CD3[T细胞(抗原)受体与CD3分子复合物]。T淋巴细胞根据其表面标志和功能特性，可以分为CD3+CD8+的抑制性T淋巴细胞(CTL)以及CD3+CD4+的辅助性T淋巴细胞(CD4+Th)。CTL细胞通过分泌颗粒酶、穿孔素、通过FasL途径等导致靶细胞的分解机凋亡[2，6，8-10]。CD4+Th细胞可继续分化为分泌型的Th细胞亚群：Th1细胞、Th2细胞、Th3细胞和Th17细胞。正常状态下，T淋巴细胞亚群数量处于一个动态平衡并且相互调节的状态。其值降低说明机体处于免疫抑制状态，易受细菌及病毒、原虫、真菌等因素感染[6，9，10-14]。
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此临床研究显示，重症组患儿血清中L、CD3%、CD8%、CD4%、CD16%、CD19%、CD3、CD8、CD4、CD16、CD19、CD4/CD8值明显低于轻症组，较健康组低，轻症组较健康组低，说明病情随着病情加重，细胞免疫功能处于明显抑制状态。其机制为：①当机体遭受手足口病毒感染，如柯萨奇病毒等后，T淋巴细胞对病毒抗原刺激无增殖性反应，T淋巴细胞产生分裂及凋亡。使大量活化的T淋巴细胞遭到清除，并且诱导T淋巴细胞克隆无反应，机体特异性免疫受到抑制[9，11，12-15]；②T淋巴细胞分化异常，CTL及CD4+Th不处于动态平衡，从而使分泌细胞因子及炎症介质，如IL-1、6、8、10，干扰素等分泌减少，使体液免疫功能受损，结果使机体清除病原体无力，病情恶化[1，5，9，12]。本研究还显示，重症组比轻症组免疫功能障碍更严重，从而说明患者病情越严重，机体的免疫功能抑制越严重，患者的预后更差。当然，由于条件所限，未能同时进行如免疫球蛋白，补体等的检测是本研究的不足之处，如能进行，将会对患儿的免疫功能监测更客观和全面。
综上所述，尽早对血清淋巴细胞亚群检测，对患儿病情的判断、临床治疗的指导具有重要意义。
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参考文献：
[1]卫生部.手足口病诊疗指南[M].北京：人民卫生出版社，2012：1-5.
[2]中华人民共和国卫生部.卫生部办公厅关于印发《手足口病诊疗指南(2010年版)》的通知[EB/OL].[2016-05-01].http：//www.moh.gov.cn/mohyzs/s3586/201004/46884.shtml.
[3]李国伟，陈巧格，王万民，等.2013-2015年郑州市重症手足口病流行特征分析[J].职业与健康，2016，32(15)：2107-2109.
[4]Stock I.Hand，foot and mouth disease more than a harmless"childhood disease"[J].Med Monatsschr Pharm，2014，37(1)：4-10.
[5]Hongyan G，Chengjie M，Qiaozhi Y，et al.Hand，foot and mouth disease caused by coxsackievirus A6，Beijing，2013[J].Pediatr Infect Dis J，2014，33(12)：1302-1303., 百拇医药(任燕)