流式细胞术研究细胞增殖的方法与技术(1)
摘要：流式细胞术是检测细胞增殖的一种重要手段，较以往的检测方法，流式细胞仪的优点在于能够实现多荧光指标同时检测，并且可以对混合样品中的特定细胞进行增殖分析，本文就目前常用细胞增殖检测染料的检测原理，应用范围及染色方法作进行阐述。
关键词：细胞增殖;流式细胞;DNA染色;示踪染料
中图分类号：R392 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.016
文章编号：1006-1959(2019)01-0047-03
Method and Technique for Cell Proliferation by Flow Cytometry
, 百拇医药
HU Nai-Li
(Central Laboratory，Capital Medical University，Beijing 100069，China)
Abstract：Flow cytometry is an important means to detect cell proliferation. Compared with previous detection methods， flow cytometry has the advantages of simultaneous detection of multiple fluorescence indicators， and can perform proliferation analysis on specific cells in mixed samples. At present， the detection principle， application range and dyeing method of cell proliferation detection dyes are commonly used.
, 百拇医药
Key words：Cell proliferation;Flow cytometry;DNA staining;Tracer dye
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。流式细胞术是一门集现代激光技术、电子技术、生物学技术为一体的高通量细胞检测技术。近年来，得益于激光技术的发展和荧光染料的开发，流式细胞术在已成为检测细胞增殖的一种重要手段，能够快速实现多参数多荧光指标的检测。本文就目前流式细胞检测增殖常用的方法与技术进行阐述。
1基于DNA含量的细胞增殖分析方法
1.1原理 利用某些荧光染料具有与DNA发生特异性结合，且被DNA结合的荧光染料的量与DNA的含量成正比，即荧光强度与荧光直方图的通道数成正比的原理，运用流式细胞仪检测出处于G0/G1期，S期和G2/M期的细胞的比例。根据仪器的不同激光配置及实验需求，有多种荧光染料可供选择。
, http://www.100md.com
1.2常用检测法 碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法：单细胞悬液经通透处理后，加入能够与DNA结合的荧光染料，此时被染荧光物质的量与DNA含量成正比，检测到荧光信号的强度即可代表DNA含量，处于G0/G1期的细胞DNA含量为二倍体，处于G2/M期的细胞DNA含量為四倍体，S期细胞染色体含量介于二倍或四倍之间，所检测的样品中，处于S和G2/M期的细胞越多，说明细胞增殖越活跃。PI可由488 nm或561 nm激发光激发，发射光谱为610～620 nm，由于PI也与双链RNA结合，所以在DNA含量检测前应对样本进行RNase消化处理，排除RNA对DNA荧光定量的影响。目前实验室绝大多数流式细胞仪配备有PI的检测通道，因此PI的应用十分广泛[1-3]。其染色优点为操作简单，可通过一步染色法实现[4]，且CV值小，荧光稳定，抗光漂白性良好。PI在使用过程中最大的限制就其光谱与其它染料的干扰问题，PI与常用染料藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)及PE检测通道的染料光谱几乎是重叠的，因此PI检测周期的样品中不能同时利用PE标记其他指标。若使用488 nm激光器激发PI，PI与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等染料也存在部分光谱重叠。
, http://www.100md.com
7-氨基-放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)也是标记DNA的染料，主要以插入方式与DNA链的G-C碱基对结合，激发波长约为580 nm，最大发射波长为640 nm。利用流式细胞仪488 nm或561 nm激光器激发均可得到良好的检测效果[5]。7-AAD属细胞膜非通透性染料，不能通过完整的细胞膜，在进行DNA染色前需对细胞进行75%冷乙醇固定处理，由于7-AAD是与DNA特异性结合，因此在染色过程中无需对样品进行RNase处理。7-AAD的发射波长较长，可与PE、FITC等常用流式染料同时使用较少发生光谱重叠。
DAPI和Hoechst33342是常用的DNA标记染料，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合，二者光谱较为接近，激发光为355 nm，最大发射光为461 nm，利用流式细胞仪的351 nm紫外激光器激发效果最佳，对于未配备紫外激光器的仪器，405 nm激光器激发也可得到良好的效果[6]。DAPI和Hoechst33342属膜通透性染料，细胞染色DNA无需乙醇固定，活细胞即可，推荐染色工作液浓度均为5～10 mg/ml，避光孵育30 min后上机检测。对于配备有355 nm或405 nm激光器的流式细胞仪而言，利用DAPI和Hoechst33342 染色细胞DNA是良好的选择。首先，二者均使用紫外或紫色激光器激发，与488 nm、561 nm、633 nm检测通道上的荧光染料不存在或较少存在光谱重叠，容易实现细胞的多指标同时检测;其次，由于DAPI和Hoechst33342对细胞膜具有通透性，可以标记活细胞的DNA，因此是两种可应用于活细胞分选的细胞周期染料。, 百拇医药(户乃丽)
关键词：细胞增殖;流式细胞;DNA染色;示踪染料
中图分类号：R392 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.016
文章编号：1006-1959(2019)01-0047-03
Method and Technique for Cell Proliferation by Flow Cytometry
, 百拇医药
HU Nai-Li
(Central Laboratory，Capital Medical University，Beijing 100069，China)
Abstract：Flow cytometry is an important means to detect cell proliferation. Compared with previous detection methods， flow cytometry has the advantages of simultaneous detection of multiple fluorescence indicators， and can perform proliferation analysis on specific cells in mixed samples. At present， the detection principle， application range and dyeing method of cell proliferation detection dyes are commonly used.
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Key words：Cell proliferation;Flow cytometry;DNA staining;Tracer dye
细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础，增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。流式细胞术是一门集现代激光技术、电子技术、生物学技术为一体的高通量细胞检测技术。近年来，得益于激光技术的发展和荧光染料的开发，流式细胞术在已成为检测细胞增殖的一种重要手段，能够快速实现多参数多荧光指标的检测。本文就目前流式细胞检测增殖常用的方法与技术进行阐述。
1基于DNA含量的细胞增殖分析方法
1.1原理 利用某些荧光染料具有与DNA发生特异性结合，且被DNA结合的荧光染料的量与DNA的含量成正比，即荧光强度与荧光直方图的通道数成正比的原理，运用流式细胞仪检测出处于G0/G1期，S期和G2/M期的细胞的比例。根据仪器的不同激光配置及实验需求，有多种荧光染料可供选择。
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1.2常用检测法 碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法：单细胞悬液经通透处理后，加入能够与DNA结合的荧光染料，此时被染荧光物质的量与DNA含量成正比，检测到荧光信号的强度即可代表DNA含量，处于G0/G1期的细胞DNA含量为二倍体，处于G2/M期的细胞DNA含量為四倍体，S期细胞染色体含量介于二倍或四倍之间，所检测的样品中，处于S和G2/M期的细胞越多，说明细胞增殖越活跃。PI可由488 nm或561 nm激发光激发，发射光谱为610～620 nm，由于PI也与双链RNA结合，所以在DNA含量检测前应对样本进行RNase消化处理，排除RNA对DNA荧光定量的影响。目前实验室绝大多数流式细胞仪配备有PI的检测通道，因此PI的应用十分广泛[1-3]。其染色优点为操作简单，可通过一步染色法实现[4]，且CV值小，荧光稳定，抗光漂白性良好。PI在使用过程中最大的限制就其光谱与其它染料的干扰问题，PI与常用染料藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)及PE检测通道的染料光谱几乎是重叠的，因此PI检测周期的样品中不能同时利用PE标记其他指标。若使用488 nm激光器激发PI，PI与异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等染料也存在部分光谱重叠。
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7-氨基-放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)也是标记DNA的染料，主要以插入方式与DNA链的G-C碱基对结合，激发波长约为580 nm，最大发射波长为640 nm。利用流式细胞仪488 nm或561 nm激光器激发均可得到良好的检测效果[5]。7-AAD属细胞膜非通透性染料，不能通过完整的细胞膜，在进行DNA染色前需对细胞进行75%冷乙醇固定处理，由于7-AAD是与DNA特异性结合，因此在染色过程中无需对样品进行RNase处理。7-AAD的发射波长较长，可与PE、FITC等常用流式染料同时使用较少发生光谱重叠。
DAPI和Hoechst33342是常用的DNA标记染料，可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合，二者光谱较为接近，激发光为355 nm，最大发射光为461 nm，利用流式细胞仪的351 nm紫外激光器激发效果最佳，对于未配备紫外激光器的仪器，405 nm激光器激发也可得到良好的效果[6]。DAPI和Hoechst33342属膜通透性染料，细胞染色DNA无需乙醇固定，活细胞即可，推荐染色工作液浓度均为5～10 mg/ml，避光孵育30 min后上机检测。对于配备有355 nm或405 nm激光器的流式细胞仪而言，利用DAPI和Hoechst33342 染色细胞DNA是良好的选择。首先，二者均使用紫外或紫色激光器激发，与488 nm、561 nm、633 nm检测通道上的荧光染料不存在或较少存在光谱重叠，容易实现细胞的多指标同时检测;其次，由于DAPI和Hoechst33342对细胞膜具有通透性，可以标记活细胞的DNA，因此是两种可应用于活细胞分选的细胞周期染料。, 百拇医药(户乃丽)