滇藁本中黄酮类化合物的提取工艺
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摘 要：目的：研究彝药滇藁本总黄酮的最佳提取工艺。方法：以槲皮素为对照品，HPLC测定的槲皮素含量和总固体物收率为指标，考察提取方法加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本总黄酮提取率的影响。结果：加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都有显著的影响，而提取时间影响最显著。最佳提取工艺为药材与70%乙醇按照1：8(g/mL)的比例，75 ℃回流提取3 h。结论：本实验优选出了滇藁本中黄酮的最佳提取工艺，为滇藁本中黄酮类化合物的进一步研究提供依据。
关键词：滇藁本；黄酮类；正交实验；高效液相法
中图分类号：R284.2文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2012)01-0053-03
彝药滇藁本为伞形科滇芹属(Sinodielsiayunnanensis Wolff)，别名岩林、岩前胡，产自云南中部和西部，始载于《滇南本草》，治头风疼痛，止诸头疼，明目[1]。彝族主要用于偏头痛，肾盂肾炎，呼吸道感染等症[2]。初步研究表明，滇藁本能减缓血细胞凝聚。为了更好的挖掘利用民族药资源，最大限度的提取其中的有效成分，笔者对滇藁本进行了醇提工艺的研究，建立了滇藁本中总黄酮类化合物的高效液相色谱测定方法。
1 材料与方法
1.1 药 材、仪器及试剂 药材：滇藁本采自红河哈尼族彝族自治州泸西县，经鉴定为伞形科滇芹属(Sinodielsiayunnanensis Wolff)的根部，粉碎过40目筛，干燥保存。试剂：盐甲醇(色谱纯)；槲皮素(对照品，中国药品生物制品检定所)；去离子水。仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪、Zorba/sb-C18色谱柱(150.0 mm ×4.6 mm，5 μm)、紫外检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及Agilent化学工作站、R-114型旋转蒸发仪(BüchI)、电热恒温水浴锅、CQX25-06超声波清洗器、AE100型电子天平。
1.2 方法和结果
1.2.1 黄酮类检测 取滇藁本药材粗粉10 g，加甲醇70 mL，置水浴中回流10 min，趁热过滤。取滤液2滴于滤纸上，加10%三氯化铝乙醇溶液2滴，挥干，置荧光灯下观察，有荧光产生。
1.2.2 提取工艺条件的确定 采用正交试验来确定滇藁本中黄酮类化合物最佳提取工艺条件。以总黄酮的提取率为评价指标，乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取方法(C)、提取时间(D)为考察的4个因素，每个因素各取3个水平(表1)，选用L9(34)正交表进行试验(表2)。取药材每份50 g，提取液过滤、减压蒸馏浓缩浸膏，再定容至50mL容量瓶中，作为供试液备用。测定前充分摇匀。按正交试验设计要求试验。
1.2.3 结果方差分析 对正交试验结果进行方差分析，由滇藁本药材粗粉中槲皮素含量的直观分析结果可知，各因素对实验结果的影响程度为A>D>B>C，所得最佳提取工艺为A3B1C1D3。由方差分析可知，提取方法、加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都有显著的影响，但提取时间影响最显著，确定最佳提取工艺为A3B1C1D3。即加8倍量的70%乙醇，热回流提取3 h。F1-0.05(2，2)=19.0,F1-0.01(2，2)=99.0,F1-0.10(2，2)=9.00。
2 实验内容
2.1 对照品贮备液的制备 取干燥至恒重的对照品，精密称定，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。
2.2 供试品溶液的制备 取样品约5 mL，用20 mL甲醇于超声波浴中提取30 min，过滤后滤液加入20 mL 1.5 mol/L盐酸于水浴上回流水解3 h，冷却后用甲醇定容至50 mL量瓶中，该样液过0.5 μm膜，滤液进HPLC分析。
2.3 测定波长的选择与色谱条件 色谱条件 固定相：Zorba/sb-C18色谱柱(150.0 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1 %磷酸(50∶50)；流速：1 0 μL /min；检测波长：371 nm；柱温：20 ℃。分离度符合要求。测定波长的选择 使用HPLC在线扫描槲皮素的对照品紫外光谱图中(以流动相为溶剂)，最大吸收波长为371 nm(见图1)。根据实验结果，为使成分的色谱峰相匹配，本实验中选择371 nm为测定波长。
图1 HPLC在线扫描槲皮素对照品紫外光谱图
2.4 系统适用性试验 分别吸取供试品及对照品溶液，注入色谱仪，在上述色谱条件下进样，得HPLC图谱(见图2(A、B)，分析得系统适用性实验结果。
2.5 标准曲线及线性范围 线性关系考察 精密称取槲皮素对照品2.9 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密吸取1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即为槲皮素对照品贮备液；精密吸取以上贮备液，按表1设计进样量进行HPLC，测定色谱峰面积，以峰面积(A)对对照品浓度(C)进行回归分析。测得如表1。
槲皮素对照品的线性回归方程为：y=32.151x+11.333，r=0.999 8。表明槲皮素在0.046 4~0.162 4 μg/mL范围内线性关系良好。
2.6 稳定性试验 在色谱条件下，取同一份滇藁本药材粗粉的供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，结果槲皮素峰面积值RSD=0.94%。表明在10 h内样品溶液中的槲皮素稳定。
2.7 精密度试验 精密吸取槲皮素对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积值，计算 RSD=0.35%。
2.8 重复性试验 同一批号样品6份，按供试品溶液制备项下方法制备并测定，结果槲皮素含量为的0.013 2%。
2.9 回收率试验 精密称取干燥至恒重的对照品适量，加入溶剂制成回收率试验用对照品储备液。取已知槲皮素含量(0.01585 mg/mL)的样品6份，每份约0.65 g，分别精密加入槲皮素对照品溶液(0.0116 mg/mL)1 mL，按供试品溶液制备项下方法制备并测定，结果平均回收率为96.44%，RSD为1.51%。
2.10 样品含量测定 取不同批号的样品数批，依测定条件，制成供试品溶液，注入色谱仪，测定，记录并计算指标槲皮素的含量。见表3。
3 讨论
滇藁本药材粗粉中含多种黄酮类化合物，根据黄酮类化合物在70%乙醇中具有良好溶解性的特点，我们在本实验中选择70%乙醇作提取溶剂。
根据实验分析滇藁本药材粗粉中黄酮类化合物大多以糖苷的形式存在，主要为槲皮素及苷、山柰素及苷等，直接测定滇藁本药材粗粉中槲皮素的含量，发现其含量很低，并且直接测定可能难以准确反映其中总黄酮的实际含量 ......
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