大鼠发育过程中下丘脑神经元钾离子通道温度效应变化的研究
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摘 要：为了探讨出生后钾离子通道在下丘脑神经元热敏感分化过程中的作用， 采用膜片钳技术研究出生一个月内SD大鼠急性分离神经元的温度效应，结果表明IK电流密度在出生后一个月内变化不大(P>0.05)，而IA电流密度则呈现为升高趋势(P0都有不同程度的升高，但相较P1d的神经元来说，温度对P18d的电压依赖性影响更大一些.同时温度对IK和IA的影响是不一样的。IA的Q10>2，所有这些显示IA通道在神经元温度敏感性的发育分化过程中起着重要的作用。
关键词：下丘脑；发育；温度；钾通道
中图分类号：Q42；Q494 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2006)01-0024-04
中枢性体温调节的本质和调控因素涉及到外周温度信息电生理信号的编码机制，在这种环境信号转化为生物信号的过程中，视前区—下丘脑前部(POAH)的神经元起着重要的作用，这种重要作用体现在不同的离子通道参与了温度信息的整合和反应。神经元的温度敏感性的形成依赖于内在的离子通道敏感机制和突触输入的特性。电压依赖性钾通道的活动能够有效地调节神经元的膜兴奋性，被认为是温度敏感神经元温度敏感机制和放电率之间建立有效联系的重要桥梁。而大鼠神经元的发育和突触形成一直持续至出生后的最初几周，在此期间，神经元的温度敏感性逐步升高，这种对涉及到下丘脑温度敏感性的表观遗传学变化的研究有利于最终揭示“体温调定点”学说。为此，我们检测了发育阶段大鼠下丘脑神经元钾离子通道的温度效应。
1 材料和方法
1.1 下丘脑脑片制作和神经元急性分离
分别取出生后(3±2)d、(18±2)d和(30±2)dSD大鼠，快速断头去脑，分离出下丘脑，迅速置于0℃的高浓度蔗糖液中，用振动切片机(WorldPrecision lnstruments MA752)切割成400lam厚的脑片，在HBSS(Sigma)液中漂洗3次后置于95%O2和5%CO2饱和的EBSS(Sigma)液中孵育1h，用针头将脑片分离成小块组织后放入32℃通100%02的含1-1.2 g/L细菌蛋白酶XⅣ(Sigma)的HBSS溶液中进行消化，漂洗后用不同管径的Paster吸管吹打成细胞悬液，静置待细胞贴壁。
1.2 电生理记录
玻璃微电极拉制后尖端直径为1～2 μm，充满电极内液后阻抗为4-S MΩ，标准电极外液成分(mmol/L)：NaCl 120，MgCl2 1，CaCl22，CsCl 1，KCl 2.8，8lucose 10，HEPES10，用NaOH调pH至7.4.标准细胞内液成分(mmol/L)：CsCl 120，MgCl2 1，EGTA 10，HEPES 10，Thapsigargin 2txmol/L，用CsOH调pH至7.3，记录在20～24℃的室温下进行.实验用CEZ2400膜片钳放大器，当电极尖端与细胞膜之间形成大于1 GΩ的高阻密封后，即形成细胞贴附式。全细胞记录模式则是在此基础上负压破膜，使电极内液与细胞内液相通后形成，调节放大器的电容-慢控制(C—slow)和电导—串联控制(G-series)来抵消瞬时电流，电流或电压信号经放大器放大后通过接口与计算机相连，经1kHz滤波，结果分析等均借助计算机用pCLAMP 9.0软件完成.浴槽液成分(mmol/L)为NaCl(125)、HEPES(10)、KCI(2，5)、MgCl2(2)、CaCl2(1)、D-glucose(10)(pH 7.2withNaOH)，电极液成分(mmol/L)为K-asparate(120)、NaCl(20)、CaCl2(2)、EGTA(0.2)、HEPES(10)(pH 7.2with KOH)。
1.3 方法
利用控温浴槽(TC-202A，HARVARDHK)改变神经元的环境温度，设置3个温度区间，每个区间的温度相差为3℃。这3个温度区间为，32～33℃、36-37℃、39-40℃，文中没有涉及温度处理的记录则是在室温下完成(20～25℃).
1.4 数据记录和分析
单通道的开放概率根据下式计算得出：
其中T为记录的时间，t为通道的开放时间，i为开放的通道数目。当通道为一级开放时，NPo=PoIA人和人电流幅度的计算按照HU(HU HJ etal，1998)和ZHANG(ZHANGC O etal.2001)等的方法，IA用电流锋值来计算，Ik用158ms处的电流值来计算。离子通道的Q10表示的是通道活动对温度的敏感度，根据下列公式计算得出：
P1和P2分别表示的是温度为T1和T2时的电流密度(FA/pF)值，实验数据以x±s表示，数据经SPSSl0.0软件包处理分析，统计方法采用ANOVA法，PA)、持续性钾电流(Ik)等类型，下丘脑神经元在出生后一个月内温度依赖性的放电特性发生变化，表明神经元在发育过程中钾通道的活动特性发生了变化，利用两种电流激活特性的差异，我们研究了不同发育时期下丘脑神经元两种类型钾通道的发育变化。图1A是在膜片钳全细胞记录模式下采用不同的电压刺激分别记录的两种钾电流。保持电位在-60mV，去极化至-100mV 200ms，给予自-40mV至+60mV的，递增20mV的阶梯去极化脉冲刺激，记录到的全细胞外向电流特点为电流快速激活，并快速回落，形成一个电流峰，在约20ms后融入稳态电流，提示此电压刺激引发的外向电流包含IK和IA两种成分；而同样保持电位和去极化至-100mV，予-50 mV 50ms失活IA后同前述给—40mV至+60mV的，递增20mV的阶梯去极化刺激，记录到的电流激活速度缓慢，约20～30ms后达到稳态，且在所测定范围内无自行失活，这种电流成分为入。对于约63%(n=11)的Pk组成了发育阶段主要的钾电流成分(图1A)，而在P>30d的神经元则90%(1l----10)可以记录到和人两种电流成分。在最大的去极化阶梯脉冲刺激电压下(V+60mV)，人电流密度在P30d时为(17，2±3.2)pA(n=10)，两者没有显著的统计学差异；相反，IA电流密度由P30 d的(56.8±2.2)pA/pF(n=7，Pm=-45mV)分别从(0，013±0，011)和(0，106 0±0.025)上升至(0.048±0.037)(n=16，Po=0.052)和(0.292±0.133)(n=16，P10)Q10A电流在3种温度下的电流活动，可以看出温度升高时，电流峰值明显增高，在去极化钳制电压在+10mV时，电流密度由(P10为(2.5±0.8)pA/pF，Q10为2.28(Q10>2)。
3 结果与讨论
下丘脑视前区和下丘脑前部(POAH)参与机体体温调节的温度感受和整合过程，在周围环境温度变化时，该区神经元发生放电频率的变化，被称为神经元的热敏感性，但涉及这种敏感的分子和细胞机制并不为人类所了解。GRIFFINJDt”等认为钾电流特别是在调节神经元的温度敏感机制方面可能起着重要作用，瞬时外向钾电流是动作电位复极早期出现的外向电流，与动作电位频率的调节存在密切关系。
本文结合神经元出生后的发育从钾通道参与细胞的温度敏感机制方面进行研究，神经元放电频率的变化有赖于发生动作电位前的去极化前电位(DPP：depolarizngprepotentials)，对于温度敏感神经元，这种前电位能够随温度变化调节动作电位间期，从而增加或减少动作电位的频率。本文结果提示IA电流随着神经元的发育而有着明显的变化，这种变化提示A电流可能是神经元温度敏感的机制。A型K+电流由于在温度升高时激活和失活快，从而参与调节DPP，这种调节可能是造成神经元温度敏感的基础。
我们重点在通道的蛋白水平比较研究了温度对发育过程中下丘脑神经元K+电流的影响，实验证实，下丘脑神经元在发育过程中，单通道的活动动力学发生明显的变化。这种变化主要体现在通道的开放概率方面，同时通道膜上的电流密度增高，所有这些变化促进了神经元温度敏感性的改变，从而分化出不同类型的温度敏感神经元，关于出生后通道密度的变化，文献上也有较多的报道，KILBORN MJ等曾报道出生10d的大鼠心肌细胞膜上的Kir和Ito发生数量上的变化，Kir减少3倍，而ho增加4倍，Gisela等对大鼠的海马神经元研究发现，出生后两天的乳鼠不能检测到火Kt通道的。亚基，6d后才可以检测到，同样，乳鼠出生后1个月内下丘脑神经元膜上通道数量也出现再分配，Kv通道数量明显增多，表现为IA电流密度升高。
综合以上结论，下丘脑神经元在出生1个月内的发育过程中，兴奋性和热敏感性都要发生一系列变化，所有的变化都围绕着神经元成熟后的功能分化进行，这包括从通道蛋白的表达和数量的调整、以及适应细胞周围环境变化而进行相应的活动动力学的调整，在此过程中，IA通道可能起着重要的作用。
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