利用核糖体展示技术筛选功能性蛋白质方法的建立
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参见附件(380KB，6页)。
摘 要：核糖体展示(ribosome display)是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。利用体外转录和翻译偶联系统可以方便而快捷地完成核糖体展示。筛选系统利用一对能够紧密结合的蛋白质：人锚蛋白(ankyrin)和红血球膜带3蛋白细胞质区域(cytoplasmic domain of erythrocyte membrane protein Band 3，Cdb3)作为模式分子，希望利用cdb3蛋白通过核糖体展示亲和选择得到锚蛋白基因.用于核糖体展示的人锚蛋白基因结构由组装PCR构建，通过PCR技术引入核糖体展示所需的结构元件。在亲和筛选步骤后，只能利用红血球膜带3蛋白筛选得到锚蛋白基因，而不能利用对照牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)筛选得到，从而说明建立的核糖体展示技术能够正常发挥作用。
关键词：核糖体展示；体外筛选；功能性蛋白；锚蛋白；红血球膜带3蛋白
中图分类号：Q781
文献标识码：A
文章编号：1007—7847(2006)01—0028—06
核糖体展示是一种体外筛选功能性蛋白质的有力的工具。首先，Mattheakis等人建立了一种用于能够展示和筛选肽的体外系统，随后由Hanes和Pluckthun等人正式建立了这种功能性蛋白体外筛选技术。迄今为止，这一技术已经被成功地应用于体外筛选与靶分子有亲和能力的功能性分子的相关领域。与其他的体内蛋白质筛选系统不同的是，核糖体展示库的建立不需要细菌转化步骤，其展示库的多样性能够得到充分保留。
在特定的反应条件下，蛋白质基因型和表型可以通过mRNA-核糖体-蛋白质三联体复合物的形式联系起来.构建的核糖体展示DNA库中，可能包含有编码靶蛋白例如功能性蛋白的DNA分子。DNA库在体外进行转录，转录后的mRNA纯化后可用于体外翻译，由于构建的mRNA分子缺乏终止子，核糖体会与mRNA的末端保持结合状态从而形成mRNA-核糖体，蛋白质三联复合物，在高浓度镁离子和低温条件下该复合物非常稳定。通过亲和结合作用，利用固定在固相或溶液中的配体，能够筛选出与其具有结合能力的复合物。加入EDTA后，可以将结合下来的复合物的mRNA洗脱下来.洗脱下来的mRNA经过纯化可以用作RT-PCR从而恢复其基因型。逆转录PCR产物也可以用于下一轮核糖体展示。整个核糖体展示过程参照图1。
红血球膜带3蛋白占人红细胞膜蛋白质的25%，是丰度最高的蛋白质，它主要包括两个结构域：跨膜区域和细胞质区域。红血球膜带3蛋白的细胞质区域是膜相关蛋白的锚定位点。锚蛋白就是其中一种能够与膜带3蛋白紧密相连的外周蛋白。我们利用这一对能够紧密结合的蛋白质分子以验证核糖体展示技术的正确建立。
在核糖体展示技术中，体外转录和翻译通常是分开进行的，在我们的这篇报道中利用体外转录翻译偶联系统，使DNA库的体外转录和翻译同时进行，从而更加方便和快捷地完成核糖体展示技术。
1 材料和方法
1，1 构建用于核糖体展示的锚蛋白基因
用于核糖体展示的锚蛋白的构建由组装PCR完成。其DNA分子模板包括一个T7启动子，转录后的RNA分子包括一个5＇—和3＇-的茎环结构 ......
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