羊松果体细胞原代培养及其生物学特性的研究
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摘 要：体外培养山羊及绵羊的松果体细胞，观察其增殖情况和功能状态的变化。结果显示：山羊、绵羊的松果体细胞体外形态及生长情况相似。细胞多呈圆形或多角形，细胞体积有增大趋势。采用MTT了法检测细胞生长状态，发现细胞有明显的增殖现象，大约于11 d达到高峰，用免疫组织化学对培养细胞进行染色， 发现5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。表明山羊和绵羊松果体细胞在体外均增殖旺盛，并能保持体内的分泌功能。
关键词：松果体细胞培养；M9了；5-HT免疫组化
中图分类号：S827
文献标识码：A
文章编号：1007—7847(2006)01—0087—04
松果体为哺乳动物的重要神经内分泌器官，产生多种胺类和肽类物质，其主要分泌物--褪黑素(MT)对许多器官的功能具有重要的调节作用。为了解松果体的生理价值，许多学者采用体外培养技术研究其细胞形态和分泌功能.体外构建松果体组织并植入动物体内成为目前研究的热点，这些研究有助于深入了解松果体的活动特点，为进一步调节动物体内松果体细胞分泌的研究积累材料。
哺乳动物松果体细胞培养早在20世纪70年代国外就有报道，1977年Rowe首次观察了体外培养大鼠松果体细胞的形态，1978年Budat成功检测了培养的大鼠松果体细胞褪黑素合成和分泌功能。本实验以山羊和绵羊作为研究对象，对其松果体进行体外培养，观察在无其他因素干扰条件下山羊和绵羊松果体细胞的形态变化、增殖过程和功能状态的异同，为研究松果体细胞分泌特点及改变动物繁殖现状提供依据。
l 材料与方法
1.1 主要实验试剂及仪器
DMEM培养液(GIBCO，美国)，M199培养液(sigma，美国)，犊牛血清(sigma，美国)，胰蛋白酶(sigma，美国)，双抗(武汉亚法)，MTr(sigma，美国)，DMSO(国产分析纯)，兔抗5-HT血清(武汉博士德)，SABC试剂盒(武汉博士德)，DAB显色试剂盒(武汉博士德)，自动酶标仪(Tecan，澳大利亚)，C02培养箱(LAB—LINE，美国)，倒置显微镜(Nikon，日本)。
1.2 松果体细胞的体外培养
按伊斯兰方法屠宰1岁龄健康莱芜黑山羊6只、小尾寒羊5只，分别进行以下步骤：迅速开颅取出松果体，冷D-hank昌液冲洗；剪碎后，0.25%胶原酶消化30min，含血清培养液中和，反复吹打，离心；加完全培养液吹打混匀，按每mL 1xl04的细胞密度分别接种于96孔培养板(分7组，每组6孔)和24孔板(分7组，每组3孔，每孔内置一盖玻片)，放人37℃、5%C02培养箱内培养。另外，本
实验中山羊采用DMEM培养液，绵羊采用M199培养液。
1.3 MTT法检测细胞增殖
从培养第3d开始，隔日取96孔板内一组细胞，每孔加入MTY 15 μL，继续培养4h后，每孔加入DMSO 30 gL，吹打至沉淀完全溶解后，在0D570。处测吸光度值并绘制曲线。
1.4 5-HT免疫组织化学方法24孔板每组从第3d开始隔日取出细胞爬片，PBS冲洗，冷95%乙醇固定10min；用正常羊血清在室温下封闭30rain；加入兔抗5—HT血清(1：100)37℃孵育2h，然后4℃过夜，PBS冲洗3rainx3；加入生物素标记的IgG，37℃ 30min，PBS冲洗3minx3；SABC复合物37℃下作用30rain，PBS洗3 minx3；DAB镜下显色5～10Min；苏木素复染，脱水，透明，封片观察。
2 结果
2.1 松果体细胞的形态观察
倒置显微镜观察体外培养的山羊、绵羊松果体细胞形态相似，大多呈圆形或多角形，x400下观察呈圆圈状。培养过程中都可见到“8”形的细胞形态，可能为正处于细胞分裂期。培养后期，细胞体积略增大，折光性减弱，但形态变化不大。另外可见具有长突起的小胶质细胞(图1、2)。
2.2 MTT检测结果
从表1和图3可以看出，体外培养的松果体细胞数量前7d增长缓慢，第9d开始分裂增殖速度加快，于第11d左右达到高峰，此后生长曲线开始缓慢下降。
2.3.5-HT免疫组化染色结果
不同培养时期都可见细胞爬片上布满棕黄色的5-HT阳性细胞，培养后期细胞的阳性反应仍然明显，松果体细胞多呈圆形或多角形，高倍镜下细胞中阳性物质呈不均质分布，细胞轮廓无明显界限，复染后核位于细胞中间，呈规则的圆形(图4、5)。培养前期随时间延长，阳性细胞数有增加现象；在11d细胞增殖达高峰后，阳性细胞数量变化不大。
3 讨论
1)体外条件下培养山羊、绵羊的松果体细胞形态相似，初期呈小圆形、折光性强，后期细胞逐渐增大、折光性减弱，这与廖华对大鼠松果体细胞的报道基本一致。
2)MTT比色法是一种检测细胞增殖情况的经典方法，酶标仪所测的OD值可反映出细胞的相对数量。从测量OD值得出的生长曲线可见，两种羊虽在不同培养液中生长，但其增殖趋势相同，松果体细胞在培养第9d开始增殖，11d左右达到高峰，随后增长缓慢。证明松果体细胞在常规培养条件下，能保持其增殖能力，细胞数目明显增加，而在成年动物体内，松果体细胞与神经元一样，数目恒定且很难再生。对于一特定动物来说，随着年龄的增长松果体细胞开始退化，同时也没有新生的细胞出现，因此松果体这一器官将逐渐衰老而无法发挥其功能。本实验发现体外松果体细胞表现出明显的增殖现象，说明体外构建松果体组织用于解决细胞的更新问题渴望成为可能。
3)褪黑素是松果体细胞的主要分泌物，而它是由色氨酸在多种酶的作用下转化而成，因此检测转化过程中的任一中间产物或酶都可反映细胞的功能状态，本实验采用目前常用的5—羟色胺免疫细胞化学染色，因为5-羟色胺作为MT的前体与MT的分泌有着密切的关系，可初步判断松果体细胞的功能状态。我们对培养不同时期的细胞爬片进行抗5—羟色胺免疫细胞化学染色，发现爬片上布满阳性细胞，细胞中含有大量呈点状的阳性颗粒，细胞多为圆形和不规则形，阳性细胞数量随细胞总数的增加而增加。证明体外增殖的松果体细胞具有合成5-HT，分泌MT的能力。
4)本研究所选的实验动物山羊、绵羊均为季节性繁殖动物，光周期是影响其生殖活动的主要环境因素。松果体分泌的褪黑素在光周期感受过程中处于调控的中心地位，褪黑素主要通过与下丘脑-垂体—性腺轴的相互作用达到动物生殖周期与环境光周期的同步变化。实验证明体外构建的松果体组织具有旺盛的增殖和分泌能力，因此可以考虑给动物植入新的松果体，并人为控制细胞的分泌状态，延长动物的繁殖季节，以达到增加繁殖率的目的。同样其它季节性繁殖动物如藏羚羊等濒临灭绝物种也可采用该方法来提高种群数目。通过本课题的研究，我们可以为人工繁殖稀有动物提供一个新的思路。
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