肺癌组织和肿瘤细胞系中BRG1的表达分析(2)
 |
| 第3页 |
 |
| 第1页 |
 |
 |
 |
参见附件(636KB，6页)。
μL，10mmol/LdNTPs 2μL，RNasinO.5μL(40U/μL)，RNase-free水补至总体积20μL，42℃反应60min，95℃灭活5min，冰上骤冷，置-20℃冰箱保存。
PCR扩增：取逆转录产物2μL，置O.5 mLEppendorf管中，分别加入10×PCR缓冲液2μL，2mmol/L dNTPs 2μL，内对照上、下游引物各0.25μL(浓度12.5mmol/L)，BRGl cDNA上、下游引物各0.75IxL(浓度12.5mmol/L)，Taq酶lU。加亚沸水至终体积20μL，20μL石蜡油覆盖，95℃预变性5min后，94℃变性30s，58℃退火50s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃再延伸5min，产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.3.3 Western印迹
蛋白质抽提：培养细胞用D-Hanks液洗涤两遍，加裂解液(2%SDS，62.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/Lβ-巯基乙醇)50-100μL；振荡混匀，冰上裂解30min；4℃ 12000r/min离心20min，吸取上清至新Eppendoff离心管中；吸少量用BCA法测定蛋白质浓度，其余加等体积2×Loading buffer(l35mmol/L Tris—HCl pH6.8，20%甘油，0.02%溴酚蓝，6%SDS，10%β-巯基乙醇)沸水浴中加热5min，-70℃保存待用.
Western blotting：每种细胞样品取100μg蛋白质于8%SDS聚丙烯酰胺凝胶120V电泳2.5h；然后100V电转移1h，使经分离的蛋白质转移至硝酸纤维素(NC)滤膜，用PBS溶解的5%脱脂牛奶室温封闭2h；羊抗人BRGl抗体1:100稀释于5%脱脂牛奶中，与滤膜在室温下于平缓摇动的摇床平台上温育1h；PBS洗膜3×15min，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗l：2500稀释于5%脱脂牛奶中，与滤膜在室温下于平缓摇动的摇床平台上温育1h；PBS洗膜3×15min ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(636KB，6页)。