人干扰素IFNα-2b在果蝇细胞中的稳定表达(1)
摘要：以人干扰素IFN-2b全长基因的质粒为模板，PCR扩增，PCR产物克隆到表达载体获得重组质粒，经转染和筛选，得到稳定表达的果蝇S2细胞株，经CuSO4诱导表达并对表达产物进行检测，结果显示，在果蝇S2细胞中成功地进行了人干扰素IFNα-2b的蛋白表达，表达产物的大小约为26kD,并且，通过体外的抗病毒活性测定，证明所表达蛋白具有抗病毒活性，该研究为进一步利用该系统表达真核细胞蛋白，研究其结构和功能提供了重要的基础。
关键词：人干扰素IFNα-2b；果蝇S2细胞；果蝇表达系统；稳定表达
中图分类号：R373
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)02-0143-04
干扰素(Interferon，IFN)是对病毒感染和其它抗原刺激应答所产生的一组宿主蛋白，根据产生干扰素细胞来源不同，理化性质和生物学活性的差异，可分为α，β，γ 3类，分别属于I型(α、β)和II(γ)型干扰素，目前认为I型(α、β)型干扰素的抗病毒作用优于II(γ)型干扰素，而II(γ)型干扰素的抗肿瘤及免疫调节功能优于I型(α、β)型干扰素，果蝇s2细胞系来源于黑腹果蝇(Droso-ohila melanogaster)晚期胚胎的培养物，该细胞系的许多特征揭示其来源于巨噬细胞样细胞系，果蝇S2细胞可在28℃或室温无CO2条件下生长，其在组织培养瓶中以松散，半贴壁的单层状态生长或在摇瓶中以悬浮状态生长，果蝇表达系统(Drosophila expression system)DES包含表达载体(pMT/BiP/V5-His A)和相应的选择载体(pCoHygro)，通过表达载体和选择载体的共转染，可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系，而且通过优化表达载体和选择载体的比例，可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系，从而提高目的蛋白的表达量。
人干扰素IFNα-2b具有许多生物学作用，包括广谱的抗病毒作用，抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫的功能，这些使得它成为治疗肿瘤性疾病，癌症和肝炎的潜在制剂，干扰素制剂有自然的和重组的两类，临床应用的干扰素主要是从大肠杆菌中获得的基因重组蛋白，而果蝇表达系统是非常出色的真核表达系统，有许多独特的优势，如比哺乳动物表达系统更高的表达量，简单的高密度细胞培养，可减少降解的分泌性表达等，我们尝试研究一下干扰素在这一系统中的表达情况。
1材料与方法
1.1果蝇S2细胞系(Schneider 2 Cells)，Wish细胞和VSV病毒
果蝇S2细胞系由健康科学研究所戈宝学研究员惠赠，用DES完全培养液培养于28℃无CO2的细胞培养箱中，其中DES完全培养液的构成为：DES培养液(HyClone公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，2mmol/LL-谷氨酰胺(Calbiochem公司)，100U/mL的青霉素和0.1g/L的链霉素。
DES Expression Vectors包含将感兴趣的目的基因克隆进去的表达载体(Expression vector)pMT/BiP/V5-HisA和一个相关的选择载体(Se-lection vector)pCoHygro，这些载体购自Invitrogen公司。
Wish细胞和VSV病毒由上海复兴公司提供，Wish细胞的培养条件是，用含10%胎牛血清(Gibco公司)的RPMI-1640(HyClone公司)培养液培养于37℃有CO2的细胞培养箱中，干扰素的标准品由上海复兴公司提供，以用作抗病毒活性测试中的对照。
其它主要试剂：小量质粒抽提及胶纯化回收试剂盒购自Qiangen公司，rr4 DNA连接酶及限制性内切酶EcoR I，Not I购自Takara公司，一抗小鼠抗人IFNα的单克隆抗体购自R&D公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自Sigma公司。
1.2人干扰素IFNα-2b表达载体的构建
含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒由上海志壮生物科技有限公司合成，为克隆至pMT/BiP/V5-His A表达载体，根据IFNα-2b基因序列，设计了两个引物，分别是：5′端GTGGAATTC-TATGTGTGACT-FGCCACA(斜体为引入的酶切位点EcoR I),3'ATAGCGGCCGCAACTCCTFAGATCTCAAAGA(斜体为引入的酶切位点Not I)，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，以含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板，PCR扩增，PCR产物克隆到pMT/BiP/V5-His A获得重组质粒pMT/BiP/V5-His A-IFNα-2b。
1.3果蝇S2细胞的稳定转化与筛选
果蝇S2细胞的转化方法部分参照文献，吸取含3×106 S2细胞的完全培养液，接种于35mm细胞培养板，28℃无CO2培养6～16h，直到细胞达到对数生长期(2～4×106/mL)，对于每一个35mm细胞培养板，准备转染试剂如下：A液(2mol/LCaC|236μL，重组DNA 19μg，pCoHygro 1μg，加去离子水至300μL)，B液(300μL 2xHBS)，逐滴缓慢将A液加入B液中，并持续摇动混匀，将所得溶液于室温孵育30～40 min，至形成沉淀，混匀溶液并逐滴加人细胞培养板中，28℃无CO2培养16～24h。
为筛选得到果蝇s2细胞稳定转染的细胞系，先去除磷酸钙，并用完全培养基将细胞洗两次，离心，重悬细胞于含300 mg/L抗生素HygromycinB的新鲜培养液中，28℃培养，每4～5d更换抗性培养液，直到抗性细胞克隆产生(需3～4周)。
1.4诱导表达与Western-blotting分析
稳定表达的细胞系建立后，使用第3代细胞诱导表达，加入硫酸铜至终浓度为500μmol/L24h后收获细胞，收集细胞培养上清，经真空低温浓缩后，对表达产物进行Western blotting分析
参照Bio-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测，将丽春红染色后的PVDF膜(Millipore公司)转移至封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)中，室温轻摇1～2 h后4℃封闭过夜；倒掉封闭液，用TBST(100 mmol/LTris-HCl，pH 7.5，150mmol/LNaCl)洗膜3次，每次10min，然后加入以封闭液1：1000稀释的一抗，室温下震荡1～1.5h；再用TBST洗膜3次，每, http://www.100md.com(孙 浩 梁布锋)
关键词：人干扰素IFNα-2b；果蝇S2细胞；果蝇表达系统；稳定表达
中图分类号：R373
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)02-0143-04
干扰素(Interferon，IFN)是对病毒感染和其它抗原刺激应答所产生的一组宿主蛋白，根据产生干扰素细胞来源不同，理化性质和生物学活性的差异，可分为α，β，γ 3类，分别属于I型(α、β)和II(γ)型干扰素，目前认为I型(α、β)型干扰素的抗病毒作用优于II(γ)型干扰素，而II(γ)型干扰素的抗肿瘤及免疫调节功能优于I型(α、β)型干扰素，果蝇s2细胞系来源于黑腹果蝇(Droso-ohila melanogaster)晚期胚胎的培养物，该细胞系的许多特征揭示其来源于巨噬细胞样细胞系，果蝇S2细胞可在28℃或室温无CO2条件下生长，其在组织培养瓶中以松散，半贴壁的单层状态生长或在摇瓶中以悬浮状态生长，果蝇表达系统(Drosophila expression system)DES包含表达载体(pMT/BiP/V5-His A)和相应的选择载体(pCoHygro)，通过表达载体和选择载体的共转染，可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系，而且通过优化表达载体和选择载体的比例，可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系，从而提高目的蛋白的表达量。
人干扰素IFNα-2b具有许多生物学作用，包括广谱的抗病毒作用，抑制肿瘤细胞增殖和增强免疫的功能，这些使得它成为治疗肿瘤性疾病，癌症和肝炎的潜在制剂，干扰素制剂有自然的和重组的两类，临床应用的干扰素主要是从大肠杆菌中获得的基因重组蛋白，而果蝇表达系统是非常出色的真核表达系统，有许多独特的优势，如比哺乳动物表达系统更高的表达量，简单的高密度细胞培养，可减少降解的分泌性表达等，我们尝试研究一下干扰素在这一系统中的表达情况。
1材料与方法
1.1果蝇S2细胞系(Schneider 2 Cells)，Wish细胞和VSV病毒
果蝇S2细胞系由健康科学研究所戈宝学研究员惠赠，用DES完全培养液培养于28℃无CO2的细胞培养箱中，其中DES完全培养液的构成为：DES培养液(HyClone公司)，10%胎牛血清(Gibco公司)，2mmol/LL-谷氨酰胺(Calbiochem公司)，100U/mL的青霉素和0.1g/L的链霉素。
DES Expression Vectors包含将感兴趣的目的基因克隆进去的表达载体(Expression vector)pMT/BiP/V5-HisA和一个相关的选择载体(Se-lection vector)pCoHygro，这些载体购自Invitrogen公司。
Wish细胞和VSV病毒由上海复兴公司提供，Wish细胞的培养条件是，用含10%胎牛血清(Gibco公司)的RPMI-1640(HyClone公司)培养液培养于37℃有CO2的细胞培养箱中，干扰素的标准品由上海复兴公司提供，以用作抗病毒活性测试中的对照。
其它主要试剂：小量质粒抽提及胶纯化回收试剂盒购自Qiangen公司，rr4 DNA连接酶及限制性内切酶EcoR I，Not I购自Takara公司，一抗小鼠抗人IFNα的单克隆抗体购自R&D公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自Sigma公司。
1.2人干扰素IFNα-2b表达载体的构建
含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒由上海志壮生物科技有限公司合成，为克隆至pMT/BiP/V5-His A表达载体，根据IFNα-2b基因序列，设计了两个引物，分别是：5′端GTGGAATTC-TATGTGTGACT-FGCCACA(斜体为引入的酶切位点EcoR I),3'ATAGCGGCCGCAACTCCTFAGATCTCAAAGA(斜体为引入的酶切位点Not I)，所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，以含有人干扰素IFNα-2b全长基因的质粒为模板，PCR扩增，PCR产物克隆到pMT/BiP/V5-His A获得重组质粒pMT/BiP/V5-His A-IFNα-2b。
1.3果蝇S2细胞的稳定转化与筛选
果蝇S2细胞的转化方法部分参照文献，吸取含3×106 S2细胞的完全培养液，接种于35mm细胞培养板，28℃无CO2培养6～16h，直到细胞达到对数生长期(2～4×106/mL)，对于每一个35mm细胞培养板，准备转染试剂如下：A液(2mol/LCaC|236μL，重组DNA 19μg，pCoHygro 1μg，加去离子水至300μL)，B液(300μL 2xHBS)，逐滴缓慢将A液加入B液中，并持续摇动混匀，将所得溶液于室温孵育30～40 min，至形成沉淀，混匀溶液并逐滴加人细胞培养板中，28℃无CO2培养16～24h。
为筛选得到果蝇s2细胞稳定转染的细胞系，先去除磷酸钙，并用完全培养基将细胞洗两次，离心，重悬细胞于含300 mg/L抗生素HygromycinB的新鲜培养液中，28℃培养，每4～5d更换抗性培养液，直到抗性细胞克隆产生(需3～4周)。
1.4诱导表达与Western-blotting分析
稳定表达的细胞系建立后，使用第3代细胞诱导表达，加入硫酸铜至终浓度为500μmol/L24h后收获细胞，收集细胞培养上清，经真空低温浓缩后，对表达产物进行Western blotting分析
参照Bio-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测，将丽春红染色后的PVDF膜(Millipore公司)转移至封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)中，室温轻摇1～2 h后4℃封闭过夜；倒掉封闭液，用TBST(100 mmol/LTris-HCl，pH 7.5，150mmol/LNaCl)洗膜3次，每次10min，然后加入以封闭液1：1000稀释的一抗，室温下震荡1～1.5h；再用TBST洗膜3次，每, http://www.100md.com(孙 浩 梁布锋)