uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达(3)
致病性，免疫反应轻微，有利于体内转染；2)可定点整合至人的19号染色体，并能较稳定的存在，从而避免了其它病毒随机整合可能引起的抑癌基因失活和原癌基因激活的危险；3)AAV携带的外源基因可以长期持续稳定表达，并可调控；4)AAV的宿主范围很广，包括分裂期和非分裂期的多种细胞：5)具有较好的热稳定性和抗酸碱性(pH 3.0～9.0)以及抗有机溶剂处理的特点，便于储存，AAV基因组具有两个开放的阅读框架(ORF)，两端各有1个145bp的末端反向重复序列(ITR)，ORF编码非结构性蛋白(Rep)和衣壳蛋白(Cap)，Rep蛋白在病毒的整合、复制、包装中起重要作用，Cap蛋白是包装成完整病毒所需的衣壳蛋白，因此，重组AAV载体(rAAV)是用外源目的基因单位(包括启动子)替换AAV两端ITR系列之间的基因系列(Rep和Cap基因)而产生，传统制备rAAV载体包装系统主要包括：重组载体、辅助质粒(如Ad8)、辅助病毒(如Ad5)和宿主细胞，该方法的缺点是可导致腺病毒蛋白的污染，容易导致机体对载体的免疫反应，各项研究通过改造AAV载体基因结构、包装细胞以及改进病毒颗粒的纯化方法，可达到更高的病毒产率，rAAV载体经过不断改进和完善，已经克服了容量小和解决无腺病毒辅助的大量包装和复制问题：近年来又由于包装细胞系的诞生，加上其固有的优点，因而成为治疗遗传性疾病和慢性疾病最有前途的基因载体。
本实验在培养的肾小管上皮细胞中直接观察到GFP的表达，提示病毒颗粒成功转染细胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在肾小管细胞中表达，大约有60%～70%的肾小管细胞可感染此病毒颗粒，并整合到肾小管细胞中稳定、高效表达，Flag蛋白的表达反应了uPA蛋白表达的情况，GFP可在450-490nm的蓝光激发下发出绿光，GFP的多肽中含有丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸的环化结构，使GFP具有强烈的荧光性，GFP作为一种基因表达的标记物优于传统的报告基因，如LacZ、CAT、luc等编码酶蛋白的基因，GFP优点在于：1)GFP基因序列短、分子质量小、融合后不影响目的基因的表达和靶蛋白生理功能，不干扰细胞的生长和功能，且对细胞无毒性作用，因而能在活细胞状态下检测基因表达；2)观察更为方便，GFP是一种能在活细胞内直接观测、无需底物和内对照的报告基因，将GFP基因转染至真核细胞中表达后，可以方便地通过观察活细胞中GFP融合蛋白的绿色荧光分布，分析未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位，因此GFP作为一种极具潜力的标记物为研究基因功能及表达调控提供了极大的便利。
本实验成功构建了高效转染多种宿主细胞的重组载体质粒，为今后建立AAV-μPA基因治疗的体内肾纤维化模型奠定了良好的基础，并且为无特殊标记细胞移植治疗提供了一种稳定、有效的标记方法，可以追踪该细胞在体内的分布或分化情况。
致谢：本实验在湖南师范大学生命科学学院生物化学与发育生物学教育部重点实验室进行，非常感谢全体老师和同学给予的帮助。
作者简介：毕凌云(1978-)，女，河南新乡人，博士研究生，主要从事小儿肾脏病研究；易著文(1946-)，男，湖南华容人，教授，博士生导师，通讯作者，主要从事小儿肾脏病研究。, 百拇医药(毕凌云 易著文 彭海宁 刘明俊 刘喜红 何庆南 党西强 吴小)
本实验在培养的肾小管上皮细胞中直接观察到GFP的表达，提示病毒颗粒成功转染细胞，pAAV-hrGFP-uPA能高效在肾小管细胞中表达，大约有60%～70%的肾小管细胞可感染此病毒颗粒，并整合到肾小管细胞中稳定、高效表达，Flag蛋白的表达反应了uPA蛋白表达的情况，GFP可在450-490nm的蓝光激发下发出绿光，GFP的多肽中含有丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸的环化结构，使GFP具有强烈的荧光性，GFP作为一种基因表达的标记物优于传统的报告基因，如LacZ、CAT、luc等编码酶蛋白的基因，GFP优点在于：1)GFP基因序列短、分子质量小、融合后不影响目的基因的表达和靶蛋白生理功能，不干扰细胞的生长和功能，且对细胞无毒性作用，因而能在活细胞状态下检测基因表达；2)观察更为方便，GFP是一种能在活细胞内直接观测、无需底物和内对照的报告基因，将GFP基因转染至真核细胞中表达后，可以方便地通过观察活细胞中GFP融合蛋白的绿色荧光分布，分析未知基因表达蛋白在细胞中的分布和定位，因此GFP作为一种极具潜力的标记物为研究基因功能及表达调控提供了极大的便利。
本实验成功构建了高效转染多种宿主细胞的重组载体质粒，为今后建立AAV-μPA基因治疗的体内肾纤维化模型奠定了良好的基础，并且为无特殊标记细胞移植治疗提供了一种稳定、有效的标记方法，可以追踪该细胞在体内的分布或分化情况。
致谢：本实验在湖南师范大学生命科学学院生物化学与发育生物学教育部重点实验室进行，非常感谢全体老师和同学给予的帮助。
作者简介：毕凌云(1978-)，女，河南新乡人，博士研究生，主要从事小儿肾脏病研究；易著文(1946-)，男，湖南华容人，教授，博士生导师，通讯作者，主要从事小儿肾脏病研究。, 百拇医药(毕凌云 易著文 彭海宁 刘明俊 刘喜红 何庆南 党西强 吴小)