遗传性β地中海贫血病CD17点突变的快速简便检测(1)
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摘 要：利用聚合酶延伸技术及双链特异性嵌入染料的特性，建立了一种快速简便的基因点突变的检测方法，在特定引物聚合过程中，不同基因型的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光信号的变化实现基因点突变的快速检测，不需要复杂的凝胶电泳、荧光和同位素标记等操作，通过对β珠蛋白基因CD17点突变的检测，证实该方法是一种廉价、简便、快速的筛查遗传性地中海贫血病β珠蛋白基因CD17点突变的方法，该方法可扩展到各种基因的点突变检测。
关键词：点突变；聚合酶；遗传性地中海贫血病；基因突变筛查
中图分类号：Q319.31 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0295-06
β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(α2β2)的卢珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成α与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病，若胎儿同时接受来自父母的两个β地贫基因，则为突变纯合子，绝大多数表现为重型β地贫疾病，目前尚无有效疗法，这些病人往往幼年夭折或靠输血维持生命，通过基因检测预防地贫患儿的出生是控制该遗传病的可行方法。
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β-地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白基因的CDl7(A→T)点突变是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一，β地贫基因突变的传统检测方法是以凝胶电泳为基础的方法。操作繁琐复杂，费时长，目前常用的诊断方法是聚合酶链反应结合斑点杂交技术，该方法准确性高，但需要放射性同位素标记和繁琐的分子杂交技术：Pun等报道了一种变性高效液相色谱基因分型新技术，无需放射性同位素标记，但这种方法操作复杂，仪器昂贵，实验周期长；新发展起来的实时荧光PCR技术已用于遗传性血色病HFE基因点突变检测，操作简便，但探针的设计难度和检测仪器成本较高，限制其广泛应用，利用双链结合染料嵌入双链DNA发出荧光的原理，我们建立了一种在常温下实时检测聚合酶活性的简便方法，本文在此基础上，基于聚合酶延伸技术和双链特异性嵌入染料特性，发展了一种快速简便的点突变实时检测方法，该方法通过染料的嵌入和荧光信号的变化实现点突变检测，不需昂贵仪器，也不需复杂的凝胶电泳操作和标记等过程，操作方便、简单，利用该方法，对β地贫疾病相关的CD17突变进行了检测，该方法为基因点突变及单核苷酸多态性的检测提供了一个快速简捷的有效方法，为药物筛选、疾病防治和单倍型计划提供一种新的手段和思路。
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1 实验
1.1 试剂与仪器
试剂：引物及寡核苷酸由大连宝生物公司(Takara)合成，序列见表1.Klenow Fragment(exo-)聚合酶(KF-酶，Fermentas)，SYBR Green I(上海科技发展有限公司)，TakaRa Ex taq酶(Takara)，dNTP Mixture(Takara)，Tris(Sigma)，二硫苏糖DTT(Bebco)，其它试剂均为国产分析纯，实验所用水均为过滤除菌的高纯水，实验器皿均经过高温灭菌，仪器：美国Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计，美国Amersham恒温水浴，ABI公司Ce-neAmPTM PCR System 2700。
1.2 实验方法
1.2.1 荧光测定
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本研究选用双链特异性结合染料SYBRGreen I，荧光强度的测定用497 nm光激发，在520nm处检测，仪器的入射狭缝与发射狭缝都设为2.5nm，样品除特别指出均在37℃恒温10min荧光值稳定后测定，样品溶液终体积均为200μL。
1.2.2 点突变检测
配制底液1(100nmol/L引物N3，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1mmol/LDTr.50 μmol/L dNTP Mixture，1×SYBR GreenI)，分别在底液1中加入终浓度为100nmol/L的N1、N2和终浓度为50nmol/L的N1/N2，配制成A、B、C 3种样液，配制底液2(100nmol/L引物N4，50mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，5mmol/LMgCl2，1mmo|/L DTF，50μmol/L dNTP Mixture(相同比例)，1×SYBR GreenI)，分别在底液2中加入终浓度为100nmol/L N1、100nmol/L的N2和终浓度为50nmol/L的N1/N2，配制成D，E，F3种样液。荧光强度稳定后分别加入2.5U KF-酶，连续监测荧光强度的变化。
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1.2.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
利用传统电泳方法验证点突变检测结果。样液A、B、C分别在95℃变性5min，然后在O℃骤冷5s，用含7%尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染分析。
1.2.4 温度对检测的影响
分别在25、30、34、37、42、47℃向样液A中加入2.5U KF-酶，监测荧光强度变化，以聚合反应1000s时的荧光信号值与未加聚合酶的荧光本底的比值(S/B)为考察标准，考察温度对检测体系的影响。
1.2.5 金属离子对检测的影响
考察M2+、Ca2+、K+、Na+4种金属离子对聚合酶聚合的影响，调整样液A中MgCl2的浓度，考察Mg2+的影响；在样液A中分别加入CaCl2、KCI、NaCl溶液调整到不同浓度，参考文献[11]计算反应初速度，考察离子对聚合反应的影响。
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1.2.6 地中海贫血遗传病点突变样品的制备以及检测
我们对地中海贫血遗传病的一种CDl7(A→T)点突变进行检测，10份样本(3份突变纯合子和3份杂合子来自南方医科大学医学遗传室，4份正常人样本来自本实验室)，样品的基因组总DNA按标准DNA提取技术从病人和正常人的外周血的白细胞中提取，引物(表1)按Primer 5.0设计，PCR体系(50νL)含有：0.5U的TakaRa Extaq酶，0.2mmol/L dNTP Mixture，1×PCR缓冲液，800nmol/L N6，10nmol/L N7及50ng总DNA，PCR反应程序如下：94℃变性5min，然后按94T变性30s，57℃退火35s，72℃延伸30s，循环40次，标准凝胶电泳法纯化PCR产物并检测OD值，在底液3(100nmol/L引物N5，50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，5mmol/L MgCl2，1mmol/LDTT，50μmol/L dNTP Mixture，1×的SYBR Green, 百拇医药(孟祥贤 栾瑞波 王柯敏 羊小海 郭秋平)