人EGFR显性负性突变体负调控内源性EGFR功能的机制分析
表皮生长因子受体(EGFR),磷酸化水平,定向克隆,亚细胞结构定位
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廖刚 王子卫 赵林 张能 董浦江 重庆医科大学附属第一医院胃肠外科;重庆医科大学附属第一医院实验研究中心;
【摘要】通过定向克隆法构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR,脂质体介导下转染体外培养的SGC-7901细胞,应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达,激光共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测;并经RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFRmRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响.成功检测到DNEGFR-EGFP蛋白的表达,DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜,DNEGFR-EGFP能降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平,而对内源性EGFRmRNA水平及蛋白水平无影响.研究证明DNEGFR通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控EGFR功能,为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤生物治疗中的进一步研究打下基础.
【关键词】 表皮生长因子受体(EGFR) 显性负性突变体 磷酸化水平 定向克隆 亚细胞结构定位
【基金】国家自然科学基金资助项目(30972872)
【分类号】Q78
表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)在肿瘤发生发展过程中扮演着重要角色,为肿瘤生物治疗的重要靶点.EGFR最重要的配体是表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)和转化生长因子α(transforminggrowth factorα,TGFα)[1],其与配体结合后,相互之间形
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摘要：通过定向克隆法构建真核表达载体pEGFPN1-DNEGFR，脂质体介导下转染体外培养的SGC-7901细胞，应用Western blotting检测DNEGFR-EGFP蛋白的表达，激光共聚焦显微镜对DNEGFR-EGFP亚细胞结构定位检测；并经RT-PCR、Western blotting检测DNEGFR-EGFP对内源性EGFR mRNA水平、蛋白及磷酸化水平的影响，成功检测到DNEGFR-FGFP蛋白的表达，DNEGFR-EGFP蛋白主要定位于细胞膜，DNEGFR-ECFP能降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平。而对内源性EGFR mRNA水平及蛋白水平无影响，研究证明DNEGFR通过降低内源性EGFR蛋白磷酸化水平负调控EGFR功能，为靶向EGFR显性负性策略在肿瘤生物治疗中的进一步研究打下基础。
关键词：表皮生长因子受体(EGFR)；显性负性突变体；磷酸化水平；定向克隆；亚细胞结构定位
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2010)03-0203-05
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