人胚胎胰腺发育中巢蛋白阳性细胞表达的变化(1)
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【摘要】目的:探索人胚胎发育过程中胰腺巢蛋白(nestin)阳性细胞表达的变化。方法:应用免疫组织化学EnVision法,检测30例人胚胎胰腺组织中巢蛋白阳性细胞的表达及分布变化。结果:各胎龄段(10～37w)胰腺均有巢蛋白阳性细胞表达,存在于胰岛、间充质和血管中,在腺泡、导管中未发现阳性细胞,胚胎发育晚期阶段(29～37w)巢蛋白阳性细胞高于其它胎龄组。结论:在人胚胎胰腺组织中存在着巢蛋白阳性细胞,该细胞主要分布于胰岛和间充质中。随着胎龄的变化,胰腺巢蛋白阳性细胞数也发生了变化。
【关键词】巢蛋白;人胚胎;胰腺;阳性细胞
【中图分类号】R321【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-015-2
胰腺干细胞移植可以用来治疗糖尿病,寻找可供移植的胰腺干细胞是近年来人们关注的热点。巢蛋白(nestin)是1990年由lendahl等鉴定出来的,属于第Ⅵ族中间丝蛋白,Mr为240000,是神经干细胞和祖细胞的标志物,也是胰岛干细胞的标志之一[1-2]。虽然已有学者对胚胎胰腺中nestin阳性细胞的表达做过研究,但仅局限在12～16周的胚胎胰腺[3-4]。对于胚胎胰腺发育过程中的阶段性表达及分布变化尚未见报道。本实验用免疫组织化学EnVision二步法,对31例10～37w人胚胎胰腺中nestin的表达进行了检测,了解其在不同胎龄胰腺中表达的差异性,探讨其生物学意义,为临床胰腺移植供体的选择和胰腺干细胞提取提供形态学资料。
1材料和方法
1.1材料和分组收集因故终止妊娠的正常胎儿31例,分成3组。A组10～19w10例,B组20～28w11例,C组29～37w10例,各胎儿均取其胰尾,入Bouin液固定20～40h,石蜡包埋制成5μm厚的连续切片。
1.2方法nestin免疫组织化学采用EnVision二步法,nestin单克隆抗体为Santa Cruz公司产品,试剂盒为DAKO公司产品。主要染色步骤:常规石蜡切片脱蜡至水,3% H2O2室温孵育20min,封闭内源性过氧化物酶,92～100℃枸椽酸缓冲液抗原修复20min,冷却20min;1:100工作浓度的nestin单克隆抗体4℃冰箱过夜;PBS冲洗3次,每次5min;滴加EnVision液室温孵育30min;PBS冲洗3次,每次5min;DAB显色,镜下控制时间,自来水冲洗;苏木精复染,酒精梯度脱水,二甲苯透明并中性树胶封片。空白对照以0.01mol/L PBS代替一抗血清进行免疫组织化学反应。Olympus CX31光学显微镜下观察并数码相机拍照。
1.3判断标准为每张切片连续观察5个高倍视野,在含有胰岛的高倍视野中计数100个细胞中nestin阳性细胞数,取其平均值。所有数据采用SPSS 11.5 for Windows统计软件进行随机区组方差分析。计量数据以均值±标准差(-x±s)表示。
2结果nestin阳性细胞呈深棕黄色,定位于细胞质。
图1 胎胰10w原始胰管和间质nestin阳性细胞EnVision法×400
Fig1 positive staining of nestin in primitive pancreatic ducting and mesenchymal cell(10week old embryo),EnVision,×400
图2 胎胰16 w nestin阳性细胞EnVision法×100
Fig2 Positive staining of nestin in embryonic pancreas(16week old fetus),EnVision,×400
2.1A组:胚胎胰腺10w时出现了原始胰管,这些原始胰管nestin全部弱阳性表达,但间充质中出现大量的nestin强阳性细胞,表达率达99%以上,因未观察到胰岛,故该例未列入统计范围(图1)。11w后胰腺内结缔组织增多,出现未形成明显腺腔的腺泡,胰岛大、小不一,14周之后胚胎胰腺中可见明显的小叶结构,能分辨出腺泡、导管和胰岛。胰岛中出现较多阳性细胞,阳性细胞分布散在,周边和中心均有;阳性部位在细胞内呈现波形分布,在核周围聚集,呈放射状发散。在胰腺的间充质、血管中也有许多阳性细胞,但未发现在腺泡和导管中的阳性细胞(图2)。B组:胚胎20～28w中可见胰岛的数量在增加,胰岛中有nestin阳性细胞,腺泡和导管中无阳性细胞,间充质中存在阳性细胞,分布于血管内皮细胞、血管壁的平滑肌细胞中。C组:29～37w胚胎中可见胰腺的外分泌部和内分泌部结构更明显,胰岛数量多,nestin阳性细胞比前阶段增多,间充质、血管中均出现nestin阳性细胞,存在于血管内皮和外层结构中,腺泡中无阳性细胞,导管中上皮外有阳性细胞(图3)。
图3 胎胰32 w nestin阳性细胞EnVision法×100
Fig3 Positive staining of nestin in embryonic pancreas(32 week old fetus),EnVision,×100
2.2经随机区组设计的方差分析,显示B组nestin阳性细胞率最低,A组与B组、C组相比较有显著性差异(P<0.05),B组与C组相比无显著性差异(P>0.05)。
附表 胚胎胰腺nestin阳性率比较(-x±s)
Tab Positive rate of nestin in embryonic pancreas(-x±s)
Group nPositive rate of nestin
A 919.16± 6.0
B 11 17.64± 4.6*
C 10 23.14± 5.9*
* 与A组相比较P<0.05
3讨论
3.1早在1985年Hockfield和Mckay首先发现巢蛋白在胚胎大鼠脊髓神经管神经前体细胞表达。该基因编码的蛋白归于中间丝蛋白,参与细胞骨架的构成。在小鼠的胚胎发育过程中,当神经胚形成时,神经板皮层细胞开始表达巢蛋白;神经细胞的迁移基本完成后,巢蛋白的表达量下降,这表明巢蛋白主要在未分化、具有分裂能力的细胞中表达,有时间顺序性,故亦将其称为神经上皮干细胞蛋白[5]。之后Hunziker等[6]首先发现在胰腺内有巢蛋白阳性细胞。Lumelsky等[7]发现巢蛋白可以作为多潜能的胰腺干细胞的标志。胰腺干细胞能在自然分化过程中首先分化为胰腺组织的各种细胞。体外分离克隆胰腺干细胞作为种子细胞,并定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗糖尿病,是解决胰岛供体短缺的有效途径 ......
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