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编号:12027317
天麻多糖的纯化工艺研究
http://www.100md.com 2010年7月1日
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    参见附件(1464KB,2页)。

     【摘要】对本实验室提取的川产天麻多糖粗提液进行分离纯化,研究结果表明:采用酶法除蛋白效果比较理想,一次就能达到比较好的效果,胰蛋白酶用量为2.0U/mg,处理时间以5h最好;酶解结合一次Sevag法再醇沉后,蛋白脱出率为90.1%;进样体积8ml、样品浓度4%、流速0.8ml/min时,Sepharose 6 Fast Flow凝胶分离效果最好。

    【关键词】天麻;多糖;纯化

    【中图分类号】R282.71【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)14-102-2

    Purification of Gastrodia elata BL Polysaccharides

    ZHU Xiao-xia,Zhang yong

    (School of Material Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Sichuan Mianyang,621010)

    Abstract:The results of methods(Sevag,enzyme and enzyme decomposition with Sevag)showed that:Enzyme method is the best one to eliminate protein with dosage of enzyme 2.0U/mg for 5 hours.Enzyme decomposition with Sevag,then precipitated with ethanol.Remove rate of protein is 90.1%。The separation conditions of Sepharose 6 Fast Flow gel are 8ml 0f sample volume,4% of samples concentration 4%,and the velocity of 0.8ml/min.

    Key word:Gastrodia elata BL;polysaccharides;purification

    糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物,可广泛应用于医药、保健品及功能食品,作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景[1]。目前多糖产品开发相当热门,也卓有成效。多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系,多糖的提取纯化是其研究的基础。活性多糖的分离纯化是指获得粗的活性多糖提取液后,除去共存杂质,进行混合糖的相互分离。微生物多糖去蛋白常采用Seveag法、三氟三氯乙烷法;植物多糖去蛋白[2]常用三氯乙酸法,也可以用蛋白质水解酶使样品中的蛋白质部分降解后,再用Seveage法效果会更好。多糖的分离一般主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、透析法、金属盐沉淀法和制备性区域电泳等,但目前大多采用DEAE-凝胶(二甲氨基乙基凝胶)或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法[3],根据文献和考虑到多糖的性质,宜采用凝胶柱层析技术进行分离。本文对天麻多糖纯化进行了详细研究。

    1原材料、试剂

    本实验室所得未经醇沉的天麻多糖粗提液[4];乙醇、氯仿、正丁醇均为成都市科龙化工试剂厂出品(分析纯AR);凝胶Sepharose 6 Fast Flow、Sephacryl-S300均为Amersham公司出品;牛血清白蛋白(中国医药上海化学试剂公司生产),考马斯亮兰G-250(中国医药上海化学试);胰蛋白酶(上海化学试剂公司)。

    2试验方法

    2.1蛋白质浓度测定

    称取牛血清白蛋白22mg,置10mL容量瓶中,加水溶解后稀释至刻度制成贮备液。分别吸取贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,加水稀释至1mL,向各管中加入5mL考马斯亮兰G-250溶液,混合均匀后,在30℃下水浴加热5min,以蒸馏水为空白,在595nm波长处测定吸光度,得回归方程为:Y=303.54x-1.983,相关系数:r=0.999,呈良好的线性关系。

    2.2天麻多糖除蛋白处理

    天麻多糖脱蛋白的目的是除去其中的游离蛋白,而对其中糖含量有无影响是该工艺必须考虑的问题。本实验采用了Sevage法和酶+Sevage法来去除蛋白质。根据正交实验结果采取最优化条件浸提天麻粗粉,得到的粗提液浓缩备用。

    2.3凝胶柱层析

    本文采用Sepharose 6 Fast Flow 凝胶,Sepharose 6 Fast Flow需要手动装柱。本文对Sepharose 6 Fast Flow凝胶的分离因素(样品体积、样品浓度、洗脱速度)进行了试验,得出最佳分离条件。

    3结果与讨论

    3.1Sevag法脱蛋白

    糖含量随着脱蛋白次数的增加而减少。经过1次-4次脱蛋白处理的天麻多糖中含糖量与其他几次处理的含糖量存在极显著差异,而经过7次脱蛋白处理与经过11次脱蛋白处理糖含量无显著差异。不同次数脱蛋白处理间天麻多糖中糖量损失的程度不同,基本上呈递减趋势,但经过前4次脱蛋白处理后天麻多糖中糖量损失最大,占所有损失量的86.9%。脱蛋白次数超过8次,糖含量变化不大。

    蛋白质含量随着脱蛋白次数的增加而减少,但减少幅度并不大,经过8次脱蛋白后天麻多糖中蛋白质含量减少了95.12%,脱蛋白的效果主要在前5次,天麻前5次脱蛋白量占总量的81.99%。采用Sevag法要将天麻多糖的蛋白质除尽,至少需要8次。

    3.2酶法脱蛋白

    酶法脱蛋白后,剩余蛋白质含量最少的效果最好,从上面的试验结果可知4、5、6号的蛋白质吸光度比较小(见表1),根据标准曲线可算出蛋白质浓度,由上表的多糖液体积可知,编号4的脱蛋白效果最好。

    3.3酶法+Sevag法脱蛋白

    利用蛋白酶降解+Sevag法除蛋白,由于酶的降解作用,使得蛋白质被酶切成小肽段,处于水溶解性较好的状态,这些小肽段用Sevag法不能沉淀出来。醇沉后,小肽段处于溶解状态被除去。酶解结合一次Sevag法再醇沉后,蛋白脱出率为76.8%,(多糖含量/蛋白含量)值达到4.24,效果比较理想,减少了后续有机溶剂除蛋白的次数,降低了多糖随凝胶物沉淀而损失的可能,多糖的得率提高。但是酶解结合Sevag法步骤繁多,工作强度较大;如采用效果较好得进口蛋白酶,成本较高。

    表2酶法结合法脱蛋白结果

    酶解前酶解一次Sevag法后醇沉后

    蛋白质含量(mg/ml)1.250.750.29

    蛋白质除率(%)_40.076.8

    多糖含量(mg/ml)2.601.661.23

    (多糖量/蛋白质量)值2.082.214.24

    3.4Sepharose 6 Fast Flow分离

    3.4.1样品体积对分辨率的影响

    样品体积是由柱长和欲分离物质所允许的分辨力来决定的。制备分离的样品体积较大,为床体积的25%-30%,分级分离时样品体积要小,一般为床体积的1%-4% ......

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