CD4+CD25+\CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+ T淋巴细胞的昼夜节律性变化(1)
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2010年8月1日
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【摘要】目的:探讨CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的昼夜节律性变化情况。方法:10名健康男性志愿者,年龄24～30岁,平均25岁。预先在昼夜节律模式条件(16h-light:8h-dark cycle,LD)下生活1周:室温25±1ºC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:00～6:00;睡眠时光照强度<0.1 Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,日常活动和饮食成分基本一致。随后在一昼夜内每隔4h抽取各受试者外周血3ml,用流式细胞仪测定CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞占CD4+T细胞的百分比,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果:在自然光制下,CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的相对数量均呈现昼高夜低的节律性振荡(P<0.05),但各细胞相对数量变化的峰谷时点略有不同。结论:人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的变化均存在着昼夜节律性特征。
【关键词】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;昼夜节律;T细胞
【中图分类号】R331.1+44【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-074-2
昼夜节律生物钟是一种普遍的生物活动现象。哺乳类动物的生物钟已被定位于下丘脑前部的视交叉上核(suprachias
-matic nucleus,SCN)和松果体[1]。近年的研究发现,免疫系统的组成和功能,如免疫细胞数量、免疫球蛋白的浓度、免疫应答和免疫调节等都存在昼夜节律性变化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞是一类已活化的免疫细胞,在免疫应答中起着重要的作用[3]。对于这些活化的T淋巴细胞的昼夜节律性的表达,到目前为止,研究报道并不多。本实验在模拟自然光制条件下,测定不同昼夜时点外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞表达的变化,以确定其是否存在昼夜节律特征。
1材料和方法
1.1研究对象与造模
10名健康男性志愿者,年龄24～30岁,平均25岁;既往身体健康,无感染性和自身免疫性疾病,在过去6个月内未做过跨时区旅行和未接受过药物治疗。预先在实验室昼夜节律模式条件(自然光制,16h-light:8h-darkcycle,LD)下生活1周:室温25±1ºC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:00～6:00;睡眠时光照强度<0.1Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,日常活动和饮食成分基本一致。
1.2样品采样
将外界自然光照起点时间设定为昼夜0时点(自然时间凌晨5时),把24h自然时点转换成昼夜时点(zeitgeber time,ZT)。受试者在实验室生活1周后,在一昼夜内每隔4h按不同昼夜时点(ZT02、06、10、14、18、22,n=6)分别采集其外周静脉血,每份取样3ml,每组(每个时点)n=10,肝素抗凝后立即于流式细胞仪检测三种细胞的百分比。
1.3仪器与试剂
Epics XL•MCL流式细胞分析仪,美国Beckman Coulter公司;CD4单克隆抗体(FITC标记),CD25单克隆抗体(PE标记),CD69单克隆抗体(PC5标记),HLA-DR单克隆抗体(PE标记),美国Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde),美国Beckman Coulter公司;PBS缓冲液,自制。
1.4流式细胞分析
取两根试管,一管加CD4单克隆抗体10μl、CD69单克隆抗体4μl和CD25单克隆抗体10μl到小试管底部,第二管加CD4、HLA-DR单克隆抗体各10μl到小试管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小试管中,避免悬液沾到试管壁。充分混匀,室温下避光放置15min。加入2501μl溶血素,振荡混匀后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS缓冲液振荡混匀后置37℃水浴15min。加入1mlPBS缓冲液振荡混匀后1800r/min离心5min,弃上清液,用滤纸吸干管壁,加入250μlPBS缓冲液,振荡混匀备用。流式细胞仪进行光路质量调控和双色荧光补偿,以前向角FSLIN与侧向角SSLIN取淋巴细胞设门,用流式细胞仪分析50000个细胞应用配套分析软件获取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR双阳性细胞占淋巴细胞的百分比。每批测定时,以空白管调整零点。
1.5数据处理
用余弦分析软件和Clock Lab软件获取昼夜节律性参数,并经振幅F检验确定靶细胞昼夜节律性表达的变化。用于拟合的余弦函数方程为:F(t)=M+Acos(ωt+Φ),其中M(mesor)为中值,即涨落变化的中线;A(amplitude)为节律振荡的振幅,表示向上或向下波动的幅度;Φ(peak phase or acrophase)为峰值相位,是振荡达到峰值的时刻,可根据ω角速度(360°/24h)将其换算成各ZT时点。数据采用mean±SD表示,组内差异用SPSS17.0 for Windows统计软件包进行t检验;组间差异用相同软件包进行方差分析(ANOVA),P<0 ......
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