花松萝的体外抑菌活性实验研究
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摘 要 为探讨花松萝不同溶剂提取物的抑菌作用，采用打孔琼脂扩散法和稀释法对花松萝不同溶剂提取物进行抑菌实验研究。结果表明花松萝的不同溶剂提取物对供试细菌和真菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌、黄霉菌)均有一定程度的抑制效果，而对粪链球菌没有抑制作用，为花松萝抑菌活性的进一步研究提供依据。
关键词 花松萝 抑菌 最小抑菌浓度 抑菌圈
松萝为松萝科松萝属植物节松萝Usnea diffracta Vain.、长松萝U.longissima Ach.和花松萝Usnea florida(L.)Wigg。以地衣体入药。全年可采，晒干备用。具有清热解毒、止咳化痰的功效，常用于肺结核(多用松萝酸的钠盐)、慢性支气管炎；松萝还用于治创伤感染、术后刀口感染、化脓性中耳炎、疮疖、淋巴结结核以及乳腺炎等[1]。
松萝广泛分布于西南、东北等地。含巴尔巴地衣酸、松萝酸、地弗地衣酸，拉马酸、地衣聚糖，原冰岛苔酸等[2][3]，松萝中的有效成分松萝酸具有较强的抑菌活性，松萝酸的抗菌谱主要为革兰氏阳性细菌及结核杆菌。在试管中，松萝酸对肺炎球菌、溶血性链球菌、白喉杆菌、结核杆菌都有很强的抑菌作用，抑菌浓度为1~5μg/ml，50μg/ml可以完全抑制细菌的生长。但也有文献记载，对革兰氏阴性的百日咳杆菌、枯草杆菌、肺炎杆菌、大肠杆菌、变形杆菌有效，而对痢疾杆菌、伤寒杆菌无效[4]。
本研究首次对花松萝不同溶剂提取物的抑制细菌和真菌的活性进行了研究，阐明其植物的抗菌特性，为花松萝的进一步开发利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
材料：花松萝购于贵州省药材公司，经鉴定为松萝科松萝属植物花松萝
试剂：石油醚，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺，均为分析纯，购于贵阳中兴化学试剂公司。
菌种：购自中国微生物菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus);大肠杆菌(Escherichia coli);粪链球菌(Enterococcus faecalis)；黄霉菌(Aspergillus flavus);绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa);藤黄微球菌(Micrococcus luteus )。培养基：MRS固体培养基：酪蛋白胨10g，牛肉提取物10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2.0g，Tween80 1.0g，磷酸氢二钾2.0g，MnSO4·H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.05g，CaCO3 20.0g，琼脂15g，定容至1 000ml，pH值 调至6.8；营养肉汤固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，定容至1 000ml，pH值调至7.0；查氏固体培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1.0g，MnSO4·H2O 0.05g，蔗糖30g，琼脂15g，液体培养基组成除了不加琼脂外，与相应的固体培养基相同。
仪器：高低温恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，旋转蒸发仪(BUCHIR-200)，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)，电子天平(OHAUS)净化工作台(上海市纯昱科学仪器有限公司)，真空冷冻干燥机(LABCONCO)，超低温冰箱(Forma Scientific)，双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司TU-1901)。
1.2 实验方法
1.2.1 花松萝不同溶剂提取物的制备方法
将干燥的花松萝粉碎过40目筛，称取等量的花松萝3份，每份150g，分别置于1 000ml的水、酒精、乙酸乙脂中。每种溶剂浸泡3次，每次置于恒温(37℃)摇床上(200r/min)震荡12小时，抽滤得到提取液。水的提取液-80℃
冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；酒精提取液40℃减压旋转浓缩除去酒精，-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；酒精提取液40℃减压旋转浓缩除去酒精，-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；乙酸乙酯提取液先减压浓缩除去乙酸乙酯，得浸膏。
1.2.2 对各部分粗提物的抑菌活性检测
1.2.2.1 菌种培养
金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)采用营养肉汤培养基(组成成分见上)活化培养，粪链球菌(Enterococcus faecalis)采用MRS培养基(组成成分见上)活化培养，黄霉菌(Aspergillus flavus)采用查氏培养基(组成成分见上)活化培养，分别将各菌种浓度调至OD600约为1，待用。
1.2.2.2 采用试管稀释法对最低抑菌浓度(MIC)的测定
取上述得到水和酒精溶剂的粗提物0.1g，溶于1ml无菌水中，乙酸乙酯溶剂的提取物0.1g溶于1mlDMF，使其充分溶解，用细菌过滤器过滤，取0.3ml样品溶液以相应的液体培养基倍比稀释成样品浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.13，1.57，0.79mg/ml，分别在试管中加入30μl菌液，置于37℃恒温培养16h。分别取100μl菌悬液均匀涂板。然后放37℃温箱静止培养24h后取出，每梯度涂布三个平板，整个过程重复2次，测定最小抑菌浓度(MIC)，筛选出抑菌活性最强的组分[5]。
1.2.2.3 抑菌圈的测定方法
取各溶剂的浸提物30mg，分别用相应的溶剂(无菌水，乙醇，乙酸乙酯)1ml,制成30mg/ml样品溶液，用细菌过滤器过滤。在相应的固体培养基平板上加0.1ml菌液，均匀涂布。稍干后用8mm打孔器打孔，每孔加0.1ml样品，37℃培养24小时，测量抑菌圈大小。
2 实验结果与分析
2.1 花松萝不同溶剂提取物MIC比较(抑菌实验结果见表1)
采用试管稀释法对花松萝3种溶剂提取物的最低抑菌浓度进行测定，结果表明花松萝的3种溶剂提取物对供试菌具有不同的抑制作用：
水溶剂浸提物对绿脓杆菌、藤黄微球菌、黄霉菌均有较好的抑制作用，最低抑菌脓度均为25mg/ml；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度均为50mg/ml；对粪链球菌的抑制作用较弱，最低抑菌浓度大于50mg/ml。
乙醇溶剂浸提物对大肠杆菌、藤黄微球菌和绿脓杆菌的抑制作用很显著，最低抑菌浓度均为12.5mg/ml；对其它的供试菌的抑制效果较好，对黄霉菌的最低抑菌浓度为25mg/ml；对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为50mg/ml，对粪链球菌的抑制作用较弱，最低抑菌浓度大于50mg/ml。
乙酸乙酯溶剂浸提物对绿脓杆菌有明显的抑制效果，最低抑菌浓度为12.5mg/ml；对其它的供试菌的抑制效果较好，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和黄霉菌的最低抑菌浓度均为25mg/ml；对大肠杆菌的最低抑菌浓度为50mg/ml，对粪链球菌的最低抑菌浓度大于50mg/ml。
从各种供试菌对花松萝浸提物的敏感性上来看，不同菌种对不同溶剂提取物的敏感性不同：黄霉菌对花松萝的水、酒精、乙酸乙酯提取物均较为敏感，最低抑菌浓度均为25mg/ml；绿脓杆菌对花松萝的酒精和乙酸乙酯的提取物均很敏感，最低抑菌浓度均为12.5mg/ml；金黄色葡萄球菌对花松萝的乙酸乙酯的提取物均较为敏感，最低抑菌浓度为25mg/ml；大肠杆菌和藤黄微球菌对花松萝的酒精提取物很敏感，最低抑菌浓度为12.5mg/ml；粪链球菌对花松萝的水、酒精、乙酸乙酯的提取物均不敏感，最低抑菌浓度均大于50mg/ml。
2.2 不同溶剂提取物的抑菌圈大小(抑菌实验结果见表2)
花松萝不同溶剂提取物对各种供试菌的抑菌活性不同；其乙酸乙酯溶剂的提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、藤黄微球菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10mm；水浸提物对藤黄微球菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10mm；乙醇浸提物对大肠杆菌、绿脓杆菌、黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10mm。
从供试菌种对不同溶剂提取物的敏感性来看，金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌对于乙酸乙酯溶剂的提取物最为敏感，抑菌圈直径均大于10mm；大肠杆菌对于酒精的浸提物最为敏感，抑菌圈直径均大于10mm；大肠杆菌对于乙醇浸提物和乙酸乙酯浸提物最为敏感，抑菌圈直径均大于10mm；粪链球菌对3种溶剂的浸提物都不敏感，抑菌圈直径均为0mm。
3 讨论
中草药几千年来为中国人的健康作出了重大贡献，在现代预防和控制细菌性感染疾病方面也发挥了积极作用。由于中药的特殊性，细菌较少对中药产生耐药。因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义[6]。
地衣类的植物多含有松萝酸，有关松萝酸各方面活性研究已经比较充分，但关于松萝属花松萝的研究却极少，我们采用体外微生物敏感试验测定方法，评价和比较了松萝属花松萝不同溶剂提取物的体外抑菌效果，实验结果表明花松萝不同溶剂提取物均有明显的体外抑菌作用，为进一步研究和开发花松萝的价值提供了基础。
参考文献
1 王丽，阿地里江，阿不都拉，孙华.松萝酸研究进展[J].生物技术通讯，2005，16(4)：472—473.
2 中国药品生物制品鉴定所.中国民族药志(第二卷)[M].北京：人民卫生出版社，1990.
3 侯团章，中草药提取物[M].北京：中国医药科技出版社，2004.
4 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编.(下册)北京：人民卫生出版社，1978：496—497.
5 沈萍，范秀容，等.微生物学实验(第3版)[M].北京高等教育出版社，1996.6.
6 曾春兰，钟振国.中药抗菌作用的研究进展.广西中医学院学报，2006，1：51—53.
(收稿日期：2007年2月1日), 百拇医药(周 英 段 震 李 燕 李纯纯 黄赤夫)