唐兆前,李 力,张 玮,王 琪,唐步坚

    多药耐药是卵巢癌化疗过程中普遍存在的现象,是影响疗效的重要因素。迄今为止对多药耐药尚无有效的预测和诊断指标供临床参考,因而处理多为后置性,这也是导致卵巢癌治疗失败的重要原因。卵巢癌多药耐药机制复杂,主要原因在于多种基因共同参与耐药性的形成。基因芯片技术是近几年在分子生物学研究方面的新技术,该技术是一项探索疾病发生发展的分子机制、提供基因诊断与治疗理论依据的前沿性生物技术。已有研究证实肿瘤组织细胞中的抑癌基因参与了多药耐药的调节机制[1-2]。本研究利用本实验室原有的卵巢癌卡铂耐药表达谱芯片,应用生物信息学方法分析筛选出17个肿瘤抑制基因,并应用 RT-PCR技术对结果进行检测和验证,为探讨卵巢癌卡铂耐药机制提供可靠的实验数据。

    1 材料与方法

    1.1 材料 RNA抽提试剂 TRIzol购自 Invitrogen公司;反转录试剂盒 Revert Aid Fiststrand cDNA Synthesis Kit购自 Fermentas公司;凝胶成像系统 quality-one,Chromo4 Real-Time PCR Detector实时荧光定量 PCR仪均购自美国 Bio-rad公司;基因芯片为 2006年上海康成生物公司制作的卵巢癌卡铂耐药细胞系 SKOV3-CB及其亲本细胞 SKOV3细胞系的表达谱芯片。SKOV3-CB细胞系较其亲本 SKOV3细胞系差异表达下调倍数两倍以上基因 1 554个。

    1.2 生物信息学分析 在 “www.ncbi.nlm.nih.gov”网站查找肿瘤抑制基因 “tumor suppressor gene”的信息,查询 1 554个基因,筛选出 17个肿瘤抑制基因。

    1.3 细胞系及细胞培养条件 化疗敏感细胞系 SKOV3系本实验室冻存,来源于中国科学院上海生物细胞研究所细胞库。耐卡铂细胞株 SKOV3/CB系本实验室模拟临床周期性化疗采用间断大剂量药物作用于亲代细胞建株诱导建立[3],耐药指数3.31。常规用 1640培养液 (含 10%的小牛血清,青霉素 G 100 U/ml,链霉素 62.5μg/ml)培养,37℃、5%CO2、0.5%胰蛋白酶消化传代。

    1.4 总 RNA提取及反转录

    1.4.1 总 RNA制备 细胞长满瓶底的 70%～80%时,收获细胞 1～5×107,移入 1.5 ml离心管中,加入 1 ml Trizol,混匀,室温静置 5min。参考 Trizol说明书依次加入 0.2ml氯仿,振荡 15 s,静置 2m in ......