付文娟，赵济华，甘洪全，翟宏芳，李琪佳

    凋亡抑制蛋白FLIP是新近发现的与恶性肿瘤的发生及转移侵袭密切相关的因子。其全称是Fas相关死亡域样白介素-1β转换酶抑制蛋白 (fas-associated death domain like IL-1 beta converting enzyme inhibitory protein，FLIP)。当肿瘤细胞中FLIP蛋白过表达时，其凋亡过程受到抑制，肿瘤细胞在体内过度堆积，而导致恶性肿瘤的发生。因而FLIP与肿瘤细胞生长密切相关，其作用不可忽视[1]。NF-κB(nuclear factorkappa B)是一类广泛存在于多种组织细胞中，具有多向转录调节作用的核蛋白因子。属于Rel家族成员，能将高等真核细胞外信号传导至核内从而引起基因特殊位点表达。NF-κB过度激活与许多病理现象有关。其中在细胞增殖与凋亡中具有核心作用。除能抑制肿瘤细胞凋亡外，还可具有促进细胞凋亡作用，因此是一种双向调节因子[2]。

    上述两种因子在骨肉瘤组织中的表达及相互关系的相关研究报导尚不多见。本研究采用免疫组织化学方法来检测FLIP、NF-κB蛋白在骨肉瘤中的表达，并采用TUNEL法检测骨肉瘤中细胞凋亡程度，探讨二者在骨肉瘤细胞增殖活性与凋亡中的相互关系，为骨肉瘤的基因治疗奠定实验基础。

    1 资料与方法

    1.1 标本采集 石蜡标本取自唐山市骨科医院及唐山市人民医院2002—2008年骨肉瘤手术石蜡标本55例 (实验组)。其中男41例，女14例，年龄12～57岁，平均 (25.3±8.4)岁。同时收集同一医院骨软骨瘤石蜡标本30例 (对照组)。选择肿瘤实质灰白色或灰红色外观区取材并进行常规病理染色，请专业病理医生确诊，后进行免疫组织化及细胞凋亡(TUNEL法)检测。

    1.2 试剂及检测方法 免抗人FLIP多克隆抗体，工作浓度1∶100。免抗人NF-κB多克隆抗体，浓度1∶160。二抗两步法免疫组织化学试剂盒 (即用型)、细胞凋亡 (TUNEL)检测试剂盒。以上试剂均购自北京中杉生物技术公司。

    石蜡切片4～5μm，实验组及对照组FLIP及NF-κB蛋白的表达强度应用免疫组织化学两步法检测。应用TUNEL法通过激光扫描共聚焦显微镜检测骨肉瘤组及骨软骨瘤组细胞凋亡。上述实验均设阳性对照及阴性对照以证明其准确性。

    1.3 实验结果的判定 FLIP阳性为肿瘤细胞质出现褐色颗粒，NF-κB阳性则细胞核出现褐色颗粒。结果统计以每例中每张切片观察5个200倍视野 (×200) ......