索 磊，杨印祥，栾 佐

    ·论著·

    ·方法学研究·

    含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

    索 磊，杨印祥，栾 佐

    目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列，设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组)，并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平，采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87，P1 材料与方法

    1.1主要材料人胶质细胞瘤细胞U251、慢病毒干扰载体〔pGCSIL-绿色荧光蛋白(GFP)质粒〕及慢病毒包装系统均由北京溯源精微科技有限公司提供；其他主要实验材料包括质粒抽提试剂盒(Omega公司)，AgeⅠ、EcoRⅠ内切酶及T4 DNA连接酶(NEB公司)，琼脂糖(上海赛百盛基因技术有限公司)，DMEM培养基及高糖DMEM培养基(Gibco公司)，β甘油磷酸钠、二磷酸维生素C、地塞米松(Sigma公司)，胎牛血清(HyCione公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，反转录试剂盒、聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(Sigma公司)及LINGO-1一抗和二抗(Abcam公司)。

    1.2方法

    1.2.1细胞的培养2015年3—11月，人胶质细胞瘤细胞U251使用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养，贴壁生长，3～4 d传代一次。

    1.2.2含人LINGO-1 shRNA慢病毒载体构建根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列(NM_001301186.1) ......